P53蛋白促進(jìn)大鼠肝原代細(xì)胞增殖的機(jī)制.pdf

1、1.目的：
　　p53基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在所有惡性腫瘤中，50％以上會出現(xiàn)該基因的突變。人們普遍認(rèn)為P53起到抑制細(xì)胞增殖的作用，但在肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)抑制P53功能的同時(shí)也抑制了細(xì)胞增殖。提示P53對于細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。最近有文獻(xiàn)報(bào)道P53是人源性或鼠源性TGFα的轉(zhuǎn)錄起始因子，同時(shí)P53也可以激活MAPK途徑，提示P53有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。本研究主要探索P53促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)理。
　　2.方法：
　　2.1、

2、細(xì)胞提取和培養(yǎng)
　　雄性成年Wistar大鼠，重200～220克，飼養(yǎng)在12小時(shí)陽光12小時(shí)黑夜條件下。肝原代細(xì)胞使用改良的體外膠原酶灌注兩步分離術(shù)提取。細(xì)胞死亡由臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。細(xì)胞種植密度為20000個(gè)/cm2。無血漿培養(yǎng)液由Williams Medium E培養(yǎng)基和Dulbecco's modified Eagle's medium按等比例混合，最終葡萄糖濃度為8.4mmol/L。培養(yǎng)基中加入青霉素(67mg/L)，鏈霉素(

3、100mg/L)，地塞米松(25nmol/L)和胰島素(100umol/L)。在種植前3個(gè)小時(shí)使用5％血漿培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后使用無血漿培養(yǎng)液培養(yǎng)在37℃，5％CO2條件下。實(shí)驗(yàn)使用10nmol/L的EGF刺激細(xì)胞。
　　2.2、Western Blotting檢測蛋白
　　培養(yǎng)的肝原代細(xì)胞使用Tris-lysis buffer(pH7.4，含60mmol/L的Tris-HCl，10％甘油，3％的硫酸鈉(SDS)，1mol/L的

4、EDTA，0.2mmol/L的AEBSF,20μmol/L亮肽素，200U/mL的抑肽酶，65μmol/L釩酸鈉和10mmol/L的β-甘油磷酸）裂解。然后裂解液進(jìn)行超聲。所有樣本的蛋白濃度使用DC protein assay檢測(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，并調(diào)整到相同濃度，最終加入β-巰基乙醇和溴酚藍(lán)并使它們的濃度分別為5％和0.0025％。樣品煮上4分鐘并貯存于-20℃條件下。樣品蛋白進(jìn)入凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至

5、硝化纖維膜上進(jìn)行隨后的分析。硝化纖維膜使用含5％牛奶的Tris-buffered saline溶液封閉，然后使用含1％牛奶的Tris-buffered saline的一抗溶液4℃孵育過夜。實(shí)驗(yàn)中使用以下抗體:鼠源性的抗Cyclin E抗體和抗P53抗體，購自Cell Signalling Technology公司，兔源性的抗Cyclin D1抗體和鼠源性的抗P21抗體，購自Upstate Biotechnology公司，抗Thr202/

6、204位點(diǎn)磷酸化的Erk抗體和抗CDK4抗體，購自Cell Signalling Technology公司，鼠源性抗β-tubulin抗體，購自Sigma-Aldrich公司，購自Fitzgerald公司，兔源性抗pY1173位點(diǎn)磷酸化的EGF受體抗體。
　　沖先后，硝化纖維膜孵育二抗溶液90分鐘，二抗為HRP連接的山羊源性抗兔IgG抗體和驢源性抗鼠IgG抗體及驢源性抗綿羊性IgG抗體，購自Sigma Aldrich公司。熒光使用

7、加強(qiáng)的化學(xué)熒光(ECL)法檢測。
　　2.3、放射滲入法檢測細(xì)胞增殖
　　肝細(xì)胞在六孔板上如上培養(yǎng)。細(xì)胞種植后48小時(shí)加入氚標(biāo)記的胸苷(1μCi/ml)。DNA合成程度由檢測到的細(xì)胞吸收的放射性胸苷來表示。六孔板由三氯乙酸沖洗兩次，每次10分鐘。剩下的細(xì)胞由0.3ml的1mol/L KOH溶解，放射性由液體閃爍儀計(jì)數(shù)。蛋白濃度測定如上。
　　2.4、ELISA檢測TGFa濃度
　　收集培養(yǎng)液并根據(jù)ELISA法說明

8、步驟檢測TGFa(靈敏度為5pg/ml)濃度。將針對TGFa膜外部分抗原決定族和整個(gè)TGFa分子抗原決定族的多克隆抗抗體固定到檢測板上（捕獲抗原），沖洗檢測板，將同量的不同組的樣品與羊抗人源性的TGFa抗體混合，然后加到檢測板上。3小時(shí)孵育后，沖洗檢測板3次后漂洗1次去除未與檢測板結(jié)合的物質(zhì)。鏈霉卵白素-過氧化物酶孵育樣本30分鐘。沖洗3次和漂洗1次后，在無光環(huán)境下發(fā)色底物鄰苯二胺孵育樣本后使用硫酸終止反應(yīng)。使用TGFa干粉和蒸餾水及緩

9、沖液配制的250，125，and63pg/ml及其它合適濃度溶液作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，分光光度計(jì)在490nm檢測樣本濃度。為了排除操作過程中溶液含有影響檢測的因子，同時(shí)檢測由緩沖液和操作溶液等比例混合配制的濃度為63，125，250pg/ml和其它合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。所有的檢測使用相同的處理步驟。
　　2.5、免疫熒光檢測蛋白細(xì)胞內(nèi)分布
　　4％甲醛溶液固定新鮮的細(xì)胞樣品10min。PBS溶液沖洗2×10min后，室溫干燥30min，

10、待樣品表面無多余液體后加一抗至細(xì)胞表面，置于濕盒內(nèi)，室溫孵育過夜。然后PBS溶液沖洗2×10min，加熒光標(biāo)記二抗溶液至細(xì)胞表面，置于濕盒內(nèi)，室溫孵育1小時(shí)。然后PBS溶液沖洗2×10min，室溫干燥30min，待樣品表面無多余液體后，將蓋玻片固定在載玻片表面，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察（60×油鏡）。
　　3、結(jié)果：
　　3.1、P53與細(xì)胞增殖
　　1)EGF刺激細(xì)胞后激活P53功能
　　在培養(yǎng)液中添加EGF刺

11、激細(xì)胞24小時(shí)或30小時(shí)后，細(xì)胞中P21的表達(dá)升高;而P53抑制劑pifithrin-α可以完全阻斷EGF誘導(dǎo)生成P21。上述結(jié)果表明EGF刺激細(xì)胞后可激活P53，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄生成P21。
　　2)Cyclin D的表達(dá)依賴P53激活
　　在培養(yǎng)液中添加EGF刺激細(xì)胞24小時(shí)和30小時(shí)后，細(xì)胞中Cyclin D的表達(dá)升高，而P53抑制劑pifithrin-α可以阻斷此一過程。結(jié)果顯示Cyclin D的生成依賴P53的激活。<

12、br>　　3)P53與細(xì)胞增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系
　　按在肝細(xì)胞EGF刺激1小時(shí)前使用P53抑制劑及抑制劑濃度分組，細(xì)胞受EGF刺激30小時(shí)后使用放射滲入法檢測各組細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果顯示P53抑制劑pifithrin-α可以抑制EGF誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖，pifithrin-α濃度與細(xì)胞增殖存在劑量反應(yīng)關(guān)系，當(dāng)pifithrin-α濃度高至30μmol/L時(shí)，將完全抑制肝細(xì)胞的增殖。
　　4)P53與細(xì)胞增殖的時(shí)效關(guān)系
　　

13、按加入P53抑制劑pifithrin-α到細(xì)胞培養(yǎng)液的時(shí)間點(diǎn)分組，EGF刺激30小時(shí)后使用放射滲入法檢測各組細(xì)胞的增殖水平。在EGF刺激細(xì)胞1小時(shí)前或第12小時(shí)使用pifithrin-α，肝細(xì)胞增殖將會完全受到抑制，而第24小時(shí)使用pifithrin-α則細(xì)胞增殖受到部分抑制。結(jié)果顯示，P53激活對細(xì)胞增殖的影響主要發(fā)生在EGF刺激細(xì)胞12小時(shí)后。
　　3.2、P53促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制
　　1)細(xì)胞分泌TGFα依賴P53激活

14、
　　EGF刺激肝細(xì)胞后24小時(shí)收集培養(yǎng)液，使用ELISA檢測培養(yǎng)液中TGFα的水平（以三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)表示）。結(jié)果顯示在未給予EGF刺激的肝細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFα低于8pg/ml，而在EGF刺激的肝細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFα為38.24pg/ml。而如果在給予EGF刺激前1小時(shí)應(yīng)用P53抑制劑pifithrin-α，則培養(yǎng)液中的TGFα為12.3pg/ml。所以EGF刺激細(xì)胞分泌TGFα依賴P53的激活。
　　2)TGFα與細(xì)胞

15、增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系
　　EGF刺激細(xì)胞30小時(shí)后使用放射滲入法檢測細(xì)胞的增殖水平。按在肝細(xì)胞EGF刺激1小時(shí)前使用中和抗體及抗體種類濃度分組，檢測各組細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示TGFα中和抗體可以抑制肝細(xì)胞增殖，而當(dāng)TGFα中和抗體濃度高至0.5mg/L時(shí)，將完全抑制肝細(xì)胞的增殖。說明肝細(xì)胞自分泌的TGFα和細(xì)胞增殖存在劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　分別將對照抗體和TGFα中和抗體與EGF混合溶解于100ul培養(yǎng)液中，1小時(shí)后將此混合液

16、分別加入正常的肝細(xì)胞培養(yǎng)液中，10分鐘后使用WESTERN BLOTTING法檢測細(xì)胞的EGF受體和ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果顯示，TGFα中和抗體與EGF的混合液并未影響EGF受體和ERK1/2的磷酸化水平，說明TGFα中和抗體與EGF并未發(fā)生特異性的交叉反應(yīng)。
　　3)TGFα與細(xì)胞增殖的時(shí)效關(guān)系
　　在EGF刺激細(xì)胞后不同時(shí)間加入TGFα抗體中和培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌的TGFα，EGF刺激30小時(shí)后使用放射滲入法檢測各組

17、細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果顯示，在EGF刺激細(xì)胞1小時(shí)前或第12小時(shí)使用TGFα中和抗體，肝細(xì)胞增殖將會完全受到抑制，而在第24小時(shí)使用TGFα中和抗體，則細(xì)胞增殖受到部分抑制。說明細(xì)胞分泌的TGFα主要在EGF刺激細(xì)胞12小時(shí)后起作用，與P53促進(jìn)細(xì)胞增殖具有相同的時(shí)效關(guān)系，提示P53通過TGFα促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　3.3、TxGFα促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制
　　1)TGFα促進(jìn)CyclinD表達(dá)
　　TGFα促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用

18、主要發(fā)生在EGF刺激細(xì)胞12小時(shí)后，因此在EGF刺激細(xì)胞12小時(shí)后加入培養(yǎng)液TGFα中和抗體，在24小時(shí)和30小時(shí)收獲細(xì)胞。結(jié)果顯示，TGFα中和抗體抑制Cyclin D的表達(dá)，說明細(xì)胞分泌的TGFα起到促進(jìn)Cyclin D表達(dá)的作用。證實(shí)了P53抑制Cyclin D的表達(dá)是通過TGFα實(shí)現(xiàn)的。
　　2)TGFα促進(jìn)Cyclin D細(xì)胞核內(nèi)分布
　　Cyclin D的功能也依賴其在細(xì)胞內(nèi)的分布，當(dāng)EGF刺激細(xì)胞30小時(shí)后，C

19、yclin D和CDK4均位于細(xì)胞核內(nèi)，而如果不給予細(xì)胞EGF刺激，則Cyclin D和CDK4均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)使用鼠源性的TGFα單克隆抗體中和培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌的TGFα后，Cyclin D和CDK4與不給予EGF刺激細(xì)胞的情況相似，仍位于細(xì)胞質(zhì)中未進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，說明細(xì)胞分泌的TGFα起到促進(jìn)Cyclin D和CDK4細(xì)胞核內(nèi)聚集的作用。
　　4.結(jié)論：
　　EGF刺激肝原代細(xì)胞后可引起P53蛋白激活，P53進(jìn)入細(xì)胞核后