Celecoxib對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及其P53表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：環(huán)氧化酶(COX)是前列腺素(PGs)合成過(guò)程中重要的限速酶，COX有COX—1和COX—2兩種形式，COX—1在人體多數(shù)組織中持續(xù)表達(dá)，維持機(jī)體正常的生理功能，對(duì)于生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子等刺激COX—1的含量無(wú)明顯變化；相反的，COX—2在正常人體絕大多數(shù)組織中無(wú)法檢測(cè)到，僅在腦、腎和結(jié)腸組織中有少量的表達(dá)，而在各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和癌基因的誘導(dǎo)下，COX-2表達(dá)量可迅速上升。近年來(lái)，許多研究表明，多種腫瘤組織存在COX-2過(guò)

2、度表達(dá)，COX-2表達(dá)上調(diào)或活性增加與腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖和凋亡耐受存在一定聯(lián)系，因此對(duì)COX-2的研究將作為惡性腫瘤防治的一個(gè)新靶點(diǎn)。有資料表明，COX-2特異性抑制劑—Celecoxib對(duì)許多實(shí)體惡性腫瘤具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡作用。子宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，對(duì)宮頸癌的治療，目前以手術(shù)結(jié)合放化療為主，這對(duì)早期宮頸癌可取得較好的療效，但對(duì)于Ib期和中晚期宮頸癌的療效并不理想。宮頸癌的化療，在治療晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者起著重要作用，因

3、此尋找有效的子宮頸癌化療藥物具有重要意義。Hela系宮頸癌細(xì)胞株，是體外研究宮頸癌的良好模型。本研究用Celecoxib作用于宮頸癌Hela細(xì)胞株，觀(guān)察Celecoxib對(duì)Hela細(xì)胞是否具有抑制增殖和凋亡誘導(dǎo)作用，并對(duì)Celecoxib抗宮頸癌作用的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。 目的：觀(guān)察Celecoxib是否具有對(duì)Hela細(xì)胞增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)的能力；檢測(cè)Celecoxib干預(yù)Hela細(xì)胞株后COX-2 mRNA和P53mRNA的

4、表達(dá)水平的變化。 方法：1用MTT比色法試驗(yàn)觀(guān)察不同濃度的Celecoxib對(duì)Hela細(xì)胞活力的影響：實(shí)驗(yàn)組設(shè)Celecoxib終濃度分別為10μmol／L，20μmol／L，40μmol／L，80μmol／L，對(duì)照組加入等體積DMSO，每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)平行孔。酶標(biāo)儀檢測(cè)。計(jì)算細(xì)胞活力。2用20μmol／L的Celecoxib干預(yù)Hela細(xì)胞，對(duì)照組加等體積DMSO。用Hoechst33258染色鑒定Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特

5、征。3用流式細(xì)胞儀分析Celecoxib作用Hela細(xì)胞24小時(shí)后的凋亡細(xì)胞百分率。4 半定量RT-PCR檢測(cè)Celecoxib干預(yù)Hela細(xì)胞24小時(shí)后P53mRNA及COX-2mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果以目的基因與β-actin的積分吸光度的比值表示。 結(jié)果：1MTT比色法實(shí)驗(yàn)顯示隨著Celecoxib濃度增高，細(xì)胞活力逐漸降低，Hela細(xì)胞各試驗(yàn)處理組細(xì)胞活力分別為對(duì)照組細(xì)胞活力的87％、46.3％、11.4％、6.2％、

6、2％，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2251.2，P<0.05)．a(chǎn) Celecoxib抑制Hela細(xì)胞活力的IC<,50>為19μmol／L；2 Hoechst33258染色顯示：對(duì)照組細(xì)胞核大小基本一致，為圓形或橢圓形，數(shù)量多，被染成均勻的淡藍(lán)色；在20μmol／L藥物濃度時(shí)，可見(jiàn)較多凋亡細(xì)胞，胞核明顯縮小，形態(tài)不規(guī)則，大小不一，可見(jiàn)呈碎塊致密濃染，形狀不規(guī)則的細(xì)胞碎片(凋亡小體)；3流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：經(jīng)不同濃度的Ce

7、lecoxib(0，10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L、80μmol／L)干預(yù)24小時(shí)后，Hela細(xì)胞的早期凋亡率逐漸升高，分別為2.42％，9.56％，21.52％，32.59％，36.34％，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=187.339，p<0.001)。4半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均在346bp處擴(kuò)增出COX.2 mRNA特異性條帶，在614bp處擴(kuò)增出P53mRNA特異性條帶，在5

8、50bp處擴(kuò)增出β-actin特異性條帶。Hela細(xì)胞中COX-2mRNA的表達(dá)水平隨著Celecoxib劑量的升高而呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，分別降低了17％、31％、52％、55％，除了40u mol／L與80μmol／L兩組間(P=0.27>0.05)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組兩組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hela細(xì)胞中P53mRNA的表達(dá)水平隨著Celecoxib劑量的升高而呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，分別升高