棉酚對人宮頸癌細胞增殖與凋亡的影響及機制研究.pdf

1、宮頸癌（cervical cancer）是一種發(fā)生在子宮頸上皮的惡性腫瘤，也是全球中僅次于乳腺癌的嚴重威脅女性健康和生命的惡性腫瘤。在我國其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，我國每年新發(fā)病例13.1萬，約占世界宮頸癌新發(fā)病例的28.8%。各個年齡段的女性都有可能患上子宮頸癌，然而，發(fā)病率及死亡率最高的人群集中在相對年輕的45歲至50歲的女性當中。近年來年青宮頸癌患者有明顯上升趨勢，保留生育功能及提高生活質(zhì)量勢在必行。宮頸癌

2、好發(fā)于社會經(jīng)濟地位低下的婦女，可能和性衛(wèi)生、HPV感染、早婚、吸煙等有關(guān)。發(fā)展中國家宮頸癌的發(fā)生率是發(fā)達國家的6倍，而且由于宮頸癌的早期篩查尚未普及，80%的患者在確診時已經(jīng)發(fā)展為浸潤癌。 目前對于宮頸癌早期主要采用手術(shù)治療或放射治療，對于中晚期以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者多采用放射治療結(jié)合全身化療的治療手段。臨床發(fā)現(xiàn)，不同患者之間，其放化療敏感性存在差異，導(dǎo)致治療效果亦有很大不同。提高放化療的劑量雖然在一定程度上可以提高療效，但

3、是不同患者的耐受性不同，并且毒副作用明顯增加，嚴重降低患者生活質(zhì)量。 Bcl-2是細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族中的重要抗凋亡蛋白，在宮頸癌等多種腫瘤高表達，這種高表達狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)以及對放化療產(chǎn)生的抵抗性密切相關(guān)。在凋亡的早期階段，位于線粒體外膜上的Bcl-2發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致PTP通道的開放，進而使線粒體膜通透性增大，釋放出如細胞色素C、凋亡蛋白激活因子-1（Apaf-1）以及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等各種活性

4、蛋白促進凋亡。細胞色素C與Apaf-1、Caspases-9組成凋亡啟動復(fù)合體使Caspases-9被激活，進一步激活Caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡。 棉酚（gossypol）是一種黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，有兩種旋光異構(gòu)體分別為左旋棉酚[（-）-gossypol]、右旋棉酚[（+）-gossypol]，目前棉酚制劑主要有3種：醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚。棉酚最初是作為一種男性避孕藥應(yīng)用于臨床，近年來研究發(fā)現(xiàn)棉酚具有顯

5、著的抗腫瘤能力，能夠?qū)Χ喾N腫瘤細胞系如前列腺癌、淋巴瘤和結(jié)腸癌等產(chǎn)生抑制腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用。研究顯示，棉酚可通過多種方式和分子靶向?qū)δ[瘤細胞進行抑制增殖和（或）誘導(dǎo)凋亡，包括通過直接損傷線粒體抑制細胞能量代謝，調(diào)低細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Rb和cyclinD1蛋白的表達，抑制蛋白激酶C活性等。大量資料表明由棉酚作用于線粒體引起的凋亡是其多種誘導(dǎo)細胞凋亡途徑中一條最為重要的細胞死亡途徑。線粒體依賴性細胞凋亡通路是指Bcl-2的表達下調(diào)

6、，引起細胞色素C從線粒體內(nèi)膜釋放，通過與Caspase-9結(jié)合，啟動Caspase-3、Caspase-7的活化，從而調(diào)控細胞凋亡。進一步的研究證實棉酚是抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL的一種小分子抑制劑，能夠特異性結(jié)合在Bcl-2/Bcl-XL的BH3位點（Bcl-2 homology domin3），阻止其與促凋亡蛋白Bax等形成異二聚體，抑制Bcl-2/Bcl-XL的抗凋亡功能，發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。 研究目的:

7、 既往國內(nèi)外關(guān)于棉酚在宮頸癌中的作用尚未見報道，本實驗擬利用高表達Bcl-2蛋白的宮頸癌細胞株Hela為研究對象，研究醋酸棉酚的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，并初步探討其可能的作用機制，同時研究比較醋酸棉酚聯(lián)合X射線對人宮頸癌細胞系的體外殺傷作用，為棉酚的進一步研究及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，奠定理論基礎(chǔ)。 實驗方法: 1.采用MTT比色法研究醋酸棉酚對宮頸癌細胞系Hela的體外增殖抑制作用，同時研究比較醋酸棉酚聯(lián)合X射

8、線對人宮頸癌細胞系的體外殺傷作用。 2.利用Hoechst33342/PI染色法觀察醋酸棉酚作用后Hela細胞核形態(tài)的變化。 3.流式細胞儀分析醋酸棉酚作用后Hela細胞的細胞凋亡率。 4.流式細胞儀分析醋酸棉酚對細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響。 5.比色法研究醋酸棉酚對Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9活性的影響。 實驗結(jié)果: 1.醋酸棉酚對Hela

9、細胞具有生長增殖抑制作用，并且這種作用呈時間、劑量依賴效應(yīng)。10μmol/L以上的醋酸棉酚作用24h即可顯著抑制Hela細胞生長，1μmol/L的醋酸棉酚則對細胞生長沒有明顯影響。 2.單純放療組與醋酸棉酚聯(lián)合射線治療組不同射線劑量Hela細胞生長抑制率分別為（7.97±1.43、15.83±1.16、27.96±1.25）%、（42.71±2.25、61.36±2.33、77.45±3.05）%。結(jié)果顯示，醋酸棉酚聯(lián)合射線治療

10、組對Hela細胞生長抑制率顯著高于單純放療組。 3.Hoechst33342/PI染色熒光顯微鏡下可見經(jīng)20μmol/L醋酸棉酚作用24h后呈致密濃染發(fā)出強藍色熒光的凋亡細胞核，而對照組則呈現(xiàn)彌散均勻，淡藍色的正常細胞核。 4.流式細胞儀可檢測到在凋亡細胞細胞周期G0/G1期前出現(xiàn)DNA亞二倍體峰，即細胞凋亡峰。本實驗中，20μmol/L的醋酸棉酚作用24h后，DNA直方圖上出現(xiàn)了亞二倍體峰，醋酸棉酚凋亡率與對照組比較，

11、差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-19.840，P=0.000）。 5.20μmol/L醋酸棉酚作用24h后，Bcl-2蛋白表達水平由對照組的（78.17±3.23）%下降至（68.97±1.94）%，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.239，P=0.013）；Bax蛋白表達水平由對照組的（8.16±0.67）%上升至（18.88±1.36）%，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-12.254，P=0.000）；Bcl-2/Bax比值與對照組比較

12、，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.734，P=0.000）。 6.20μmol/L醋酸棉酚作用后先后出現(xiàn)Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9蛋白酶的活性變化。12h、24h、48h時間點Hela細胞Caspase-3（2.32±0.15、5.44±0.20、4.34±0.04），Caspase-8（3.70±0.15、5.45±0.20、2.36±0.16），Caspase-9（4.36±0.33、6.40

13、±0.19、2.84±0.08）的活化程度逐漸增高，至24h達到高峰，隨后活性逐漸下降。 主要結(jié)論: 本研究證實醋酸棉酚對宮頸癌細胞株Hela具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，其作用機制可能與Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，以及Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9蛋白酶的激活有關(guān)。醋酸棉酚誘導(dǎo)Hela細胞凋亡是由線粒體途徑及死亡受體途徑共同完成的。醋酸棉酚聯(lián)合X射線能夠增強X射線對宮頸癌細胞株