宮頸癌中Pin1過表達(dá)對(duì)cyclin D1調(diào)節(jié)及其在宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)序列中絲/蘇-脯氨酰基序的磷酸化是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制，主要關(guān)系到細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。近年來研究發(fā)現(xiàn)：磷酸化的絲/蘇-脯氨?；蜻€需要被Pin1特異識(shí)別催化，依賴Pin1的構(gòu)型轉(zhuǎn)變是新的蛋白磷酸化后調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，其功能失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。Pin1在人類多種腫瘤中存在過表達(dá)，對(duì)多種致癌信號(hào)具有協(xié)同加強(qiáng)作用，被稱為腫瘤發(fā)生發(fā)展的“催化分子”。Pin1過表達(dá)在實(shí)體瘤如乳腺癌、前列腺癌發(fā)生

2、中起關(guān)鍵的催化作用，且與臨床預(yù)后密切相關(guān)。宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，屬于實(shí)體瘤，是導(dǎo)致婦女發(fā)生癌相關(guān)死亡的首要原因。盡管宮頸癌發(fā)生的確切的分子機(jī)制并不清楚，但研究表明：HPV與宮頸癌關(guān)系密切，在HPVE6/E7致癌信號(hào)通路中，多種癌信號(hào)分子因含有共同的絲/蘇-脯氨?；蚩赡苁躊in1特異性調(diào)控，如cyclinD1，Ki67，P53NF-κB等，其中cyclinD1過度表達(dá)可加速細(xì)胞增殖，在HPVE6/E7致癌中扮演著重要角色，cyc

3、linD1是HPVE6/E7致癌所必不可少的成分。體內(nèi)、外研究顯示：刪除cyclinD1，則HPVE6/E7不能誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖。但cyclinD1過表達(dá)的機(jī)制不明。有趣的是Pin1過表達(dá)不僅在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)cyclinD1表達(dá)，而且還通過催化cyclinD1發(fā)生順反異構(gòu)，阻止其降解，導(dǎo)致cyclinD1蓄積于細(xì)胞核內(nèi)，處于持續(xù)激活狀態(tài)，加速乳腺上皮細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。推測(cè)Pin1可能也作為催化分子經(jīng)上調(diào)cyclinD1參與宮頸癌發(fā)生

4、，Pin1過表達(dá)過度激活cyclinD1可加強(qiáng)致癌信號(hào)、擾亂細(xì)胞內(nèi)信號(hào)穩(wěn)態(tài)，可能是引起宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和增殖失控的重要因素。然而，Pin1在宮頸癌中表達(dá)及其與cyclinD1關(guān)系的研究尚未見報(bào)道，阻抑Pin1是否影響宮頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成亦不清楚。因此本課題擬進(jìn)行如下研究： 目的：1.明確Pin1、cyclinD1在宮頸癌中的表達(dá)狀況及其臨床意義；2.研究Pin1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及對(duì)cyclinD1表達(dá)的影

5、響；3.探索靶向Pin1基因沉默阻抑宮頸癌發(fā)生和細(xì)胞增殖的可能性。 方法：1.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)57例宮頸癌，21例CIN，10例正常宮頸組織中Pin1，cyclinD1和Ki67的表達(dá)，分析其相關(guān)性及臨床意義；同時(shí)RT-PCR法檢測(cè)其中15例宮頸癌，5例正常宮頸組織中Pin1mRNA的表達(dá)； 2.RT-PCR，免疫印跡法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)4株宮頸癌細(xì)胞HeLa，Siha，C33a，Caski中Pin1mRNA和蛋白的

6、表達(dá)； 3.構(gòu)建Pin1正義質(zhì)粒，上調(diào)Pin1基因表達(dá)；免疫印跡法，MTT比色法，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀分析上調(diào)Pin1基因?qū)yclinD1表達(dá)及宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響； 4.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，短發(fā)夾狀RNA特異性沉默Pin1基因表達(dá)；免疫印跡法，MTT比色法，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀分析下調(diào)Pin1基因?qū)yclinD1表達(dá)及宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。 結(jié)果：1.宮頸癌組織中Pin1mR

7、NA和蛋白表達(dá)明顯高于正常宮頸組織(p＜0.05)；從正常宮頸到CIN再到浸潤(rùn)癌Pin1蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)(p＜0.05)；Pin1蛋白過表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)(p＞0.05)；但宮頸腺癌中Pin1表達(dá)明顯高于宮頸鱗癌(p＜0.05)；Pin1過表達(dá)與cyclinD1，Ki67表達(dá)密切相關(guān)(p＜0.05)。 2.HeLa、Siha、C33a、Caski宮頸癌細(xì)胞株存在不同程度Pin1mRNA及蛋白過表達(dá)(p

8、＜0.05)。 3.在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，上調(diào)Pin1可增加內(nèi)源性cyclinD1表達(dá)，下調(diào)Pin1可降低內(nèi)源性cyclinD1表達(dá)(p＜0.05)。 4.特異性沉默Pin1基因可阻抑宮頸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡(p＜0.05)；外源性增加Pin1基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)明顯影響(p＞0.05)。 結(jié)論：1.Pin1在宮頸癌組織和細(xì)胞中均存在mRNA及蛋白水平上的過表達(dá)，Pin1過表達(dá)與cyclinD1，K