S100A9對宮頸癌細胞的增殖和遷移的作用及其機制研究.pdf

1、目的：S100家族是EF-手型鈣結(jié)合蛋白家族中最大的多基因家族，絕大部分作為鈣受體結(jié)合蛋白發(fā)揮作用，參與細胞結(jié)構(gòu)的形成、酶活性的調(diào)節(jié)及細胞間信號傳導等。該家族中16個成員（包括 S100A9）的基因定位于1號染色體長臂2區(qū)1帶（1q21），該區(qū)段穩(wěn)定性較差，易發(fā)生多種染色體重排，從而引起 S100基因表達的失控。近年來發(fā)現(xiàn)S100異常表達于多種腫瘤組織中，且與疾病的分期和預(yù)后相關(guān)。S100A9（calgranulin B,MRP14）是

2、S100蛋白家族的成員，最初發(fā)現(xiàn)表達于髓系細胞分化過程中，且以粒細胞和單核細胞中表達最高。越來越多研究證實多種腫瘤中也存在S100A9的高表達；我們前期發(fā)現(xiàn)S100A9促進肝癌 HepG2細胞的增殖和侵襲、促進結(jié)直腸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果都提示S100A9與腫瘤的發(fā)生發(fā)展較為相關(guān)。但其對腫瘤的作用及其機制、以及在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義等都尚待探討。宮頸癌發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之首，直接蔓延為其最常見的播散方式，向前侵犯

3、膀胱，向后侵犯直腸。其次，由于宮旁淋巴管豐富，淋巴轉(zhuǎn)移也是其擴散的主要途徑。腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移給病人帶來極大的痛苦，甚至威脅生命。因此，明確宮頸癌遷移的具體機制對于降低患者病死率及改善預(yù)后具有重要意義。用基因芯片檢測宮頸鱗癌和癌旁宮頸組織的差異表達基因時，發(fā)現(xiàn)S100A9在宮頸鱗癌中的表達更高，提示S100A9可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，本研究以宮頸癌細胞為實驗對象,觀察S100A9對其增殖及轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討其分子機制，為闡

4、明宮頸癌發(fā)生發(fā)展積累實驗依據(jù)，也可望為宮頸癌的診斷及治療提供新思路。
　　方法：①干擾人S100A9基因表達的重組腺病毒AdsiS100A9及其對照腺病毒AdsiControl的構(gòu)建、包裝：將針對人S100A9基因的干擾序列及其無關(guān)序列（對照）分別插入pSES1中，然后轉(zhuǎn)化BJ5183，與pAdEasy進行重組，挑選針尖樣大小單克隆菌落，提質(zhì)粒，PacⅠ酶切鑒定后，將PacⅠ酶切后線性化的質(zhì)粒在lipo2000輔助下轉(zhuǎn)染HEK29

5、3細胞，進行病毒包裝。②用HEK293細胞擴增所需重組腺病毒：包括 AdsiS100A9、AdsiControl、攜帶人 S100A9基因的重組腺病毒 AdS100A9及其對照AdGFP。③檢測三株宮頸癌細胞系（Siha、Caski和 Hela）中 S100A9的內(nèi)源性表達；分別用 AdS100A9和 AdsiS100A9感染低表達和高表達S100A9的Hela和Siha細胞，再用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法確認被感染細胞中S100A9基

6、因表達的上調(diào)和下調(diào)。④S100A9對宮頸癌Hela和Siha細胞的增殖和遷移的影響：利用AdS100A9和AdsiS100A9分別感染Hela和Siha細胞,分別用MTT法、劃痕愈合試驗和Transwell試驗檢測其增殖及遷移能力的變化。⑤S100A9對宮頸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（ Epithelial-mesenchymal transition, EMT）的影響：AdS100A9和AdsiS100A9分別感染于Hela和Siha細胞后，

7、蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光檢測EMT標志物E-cadherin、Vimentin的水平變化。⑥S100A9對宮頸癌細胞中 Wnt/β-catenin信號活性的影響：AdS100A9和AdsiS100A9分別感染Hela和Siha細胞后,RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵信號分子β-catenin（全部的及胞核內(nèi)的）以及下游靶基因c-myc、Snail和Twist的表達。⑦Wnt/β-catenin信號通路在

8、S100A9誘導宮頸癌細胞增殖和遷移的作用：聯(lián)合使用重組蛋白GST-hS100A9和β-catenin的重組干擾腺病毒（Adsiβ-catenin）處理Hela細胞，經(jīng)MTT法和Transwell試驗檢測其增殖和遷移能力的變化。⑧Wnt/β-catenin信號通路在S100A9誘導宮頸癌細胞發(fā)生EMT中的作用：聯(lián)合使用重組蛋白 GST-hS100A9和 Adsiβ-catenin處理 Hela細胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測EMT標志物E-cad

9、herin、Vimentin水平的變化。
　　結(jié)果：⑴構(gòu)建S100A9的 siRNA質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入 BJ5183細胞中與pAdEasy進行同源重組，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293細胞后，熒光顯微鏡下可見細胞中的紅色熒光逐漸增強；于7-9d后收集細胞，反復凍融以裂解細胞，3次后收獲 AdsiS100A9；相同方法獲得其對照腺病毒AdsiControl。至此，完成AdsiS100A9和AdsiControl的包裝。⑵將待擴增的病毒 A

10、dS100A9、AdGFP和 AdsiS100A9、AdsiControl感染HEK293細胞，24、36和48小時后的HEK293細胞中分別可見逐漸增強的綠色熒光和紅色熒光；待80％以上細胞變圓、少數(shù)細胞脫落漂浮時收獲細胞，凍融裂解，收獲病毒，再進行逐輪擴增；病毒分裝凍存于-20℃?zhèn)溆?。⑶這三株宮頸癌細胞系中，S100A9的表達以Hela細胞最低，Siha細胞略高于Caski。AdS100A9和AdGFP感染Hela細胞后，AdS10

11、0A9組的細胞中S100A9 mRNA和蛋白水平顯著高于空白組和GFP組（即AdGFP感染組）；AdsiS100A9及 AdsiControl感染 Siha細胞后， AdsiS100A9組的細胞中S100A9 mRNA和蛋白水平顯著低于空白組和siControl組（即AdsiControl感染組）。⑷S100A9促進宮頸癌細胞的增殖（MTT）：Hela細胞：按實驗設(shè)計用 AdS100A9等處理各組細胞；第1、2d，三組細胞之間的OD49

12、0nm值（OD值）無明顯差異；到第3d，空白組、GFP組及S100A9過表達組的 OD值分別為0.870±0.124、0.833±0.164和1.257±0.158， S100A9過表達組的OD值顯著高于GFP組（P<0.05）；Siha細胞：三組細胞在AdsiS100A9等相應(yīng)處理后，其增殖能力在1d、2d無明顯差異；到第3d，空白組、siControl組及S100A9干擾組的OD值分別為1.190±0.206、1.113±0.179

13、和0.683±0.066，S100A9干擾組的OD值顯著低于siControl組（P<0.05）。⑸Hela細胞：劃痕24h后，S100A9過表達組的劃痕愈合能力顯著高于空白組和 GFP組；Transwell試驗結(jié)果與之一致，即：S100A9過表達組的穿膜細胞數(shù)為（128.67±22.03）個，明顯高于空白組（74.67±14.05）和GFP組（66.00±14.42）個，差異具有顯著性（P<0.05）；⑹Siha細胞：劃痕36h后，S

14、100A9干擾組的劃痕愈合能力明顯低于空白組和siControl組；Transwell試驗結(jié)果與之一致，即：S100A9干擾組的穿膜細胞數(shù)為（77.50±7.77）個，明顯低于空白組（182.5±10.61）和siControl組（155.50±4.94），差異具有高度顯著性（P<0.01）。⑺蛋白質(zhì)印跡法和細胞免疫熒光檢測的結(jié)果一致顯示：S100A9過表達的Hela細胞內(nèi)的E-cadherin水平低于GFP組（P<0.05），Vime

15、ntin水平則高于GFP組（P<0.01）；S100A9干擾組的Siha細胞內(nèi)E-cadherin高于 siControl組（ P<0.01），而 Vimentin水平則低于 siControl組（P<0.05）。⑻S100A9過表達的Hela細胞內(nèi)總的及胞核內(nèi)的β-catenin水平均高于GFP組，分別是GFP組的1.43倍和2.12倍（P<0.01），并且該通路的下游靶基因c-myc、Snail和Twist的mRNA水平也均高于GF

16、P組（P<0.05；P<0.01；P<0.05）；⑼S100A9表達下調(diào)的Siha細胞內(nèi)總的及胞核內(nèi)的β-catenin水平則低于 siControl組，分別為 siControl組的27%（P<0.001）和50%（P<0.05），該通路下游的c-myc、Snail和Twist的mRNA水平也均低于siControl組（P<0.01；P<0.01；P<0.001）。⑽Adsiβ-catenin可下調(diào)β-catenin的表達，聯(lián)合使用G

17、ST-hS100A9和Adsiβ-catenin處理Hela細胞，我們發(fā)現(xiàn)β-catenin的下調(diào)能夠部分抑制S100A9誘導的Hela細胞增殖和遷移。⑾聯(lián)合使用GST-hS100A9和Adsiβ-catenin處理Hela細胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示β-catenin的下調(diào)能夠部分阻斷 S100A9引起的E-cadherin的下調(diào)和Vimentin的上調(diào)。
　　結(jié)論：①S100A9促進宮頸癌細胞的增殖和遷移。②S100A9促進宮頸