CD73過表達促進宮頸癌細胞增殖及遷移能力的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　CD73是一種糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白，由NT5E基因編碼。CD73具有雙重功能：首先，CD73具有水解酶活性，可催化5，-單磷酸腺苷（AMP）水解生成腺苷。腺苷是機體內微環(huán)境中一種重要的信號分子，對機體免疫應答具有負調控作用，因此CD73在腫瘤細胞的免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。其次，CD73還具有非水解酶功能，研究顯示，CD73具有信號轉導功能，可參與細胞的增殖、粘附等生物學行為的調控。近些年研究發(fā)現(xiàn)，CD73在多種

2、類型的腫瘤中過表達，對腫瘤細胞的增殖、遷移能力具有促進作用。臨床回顧性研究表明CD73過表達與胃癌、結直腸癌、前列腺癌等腫瘤患者的臨床病理分級、轉移、預后等指標相關，然而CD73在宮頸癌中的作用尚未明確。本文擬利用宮頸癌細胞系Hela、SiHa為模型，通過體外構建CD73過表達的細胞株Hela-CD73及SiHa-CD73，檢測CD73過表達對宮頸癌細胞增殖、遷移等生物學行為的影響，揭示 CD73在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，并通過進

3、一步檢測CD73酶活性抑制劑-APCP以及CD73酶活性產(chǎn)物-腺苷對宮頸癌細胞生物學行為的影響，分析CD73在宮頸癌細胞中的作用是否依賴其水解酶活性，最后通過檢測CD73對EGFR/Akt及VEGF/Akt通路活性的影響，初步揭示CD73在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制。
　　方法：
　?。?）構建CD73真核表達載體，轉染宮頸癌細胞系Hela及SiHa，篩選CD73過表達細胞株，RT-PCR及western-blot鑒定

4、后命名為Hela-CD73及SiHa-CD73，MTT實驗檢測CD73過表達對宮頸癌細胞增殖速度的影響，劃痕修復實驗檢測CD73過表達對宮頸癌細胞遷移能力的影響；
　?。?）利用CD73酶活性抑制劑-APCP處理Hela-CD73及SiHa-CD73細胞，MTT實驗檢測APCP對過表達細胞增殖速度的影響，劃痕修復實驗檢測 APCP對過表達細胞遷移能力的影響，流式細胞術檢測CD73酶活性抑制劑-APCP對過表達細胞凋亡、周期的影響；

5、
　?。?）利用CD73水解酶活性產(chǎn)物-腺苷處理宮頸癌細胞，MTT實驗檢測腺苷對細胞增殖的影響，劃痕修復實驗檢測腺苷對細胞遷移能力的影響，流式細胞術檢測腺苷對細胞凋亡、周期的影響，并用RT-PCR及western-blot技術分別檢測凋亡相關分子及蛋白（Bax、Bak、Caspase-3和Bcl-2）的表達（；
　?。?）利用RT-PCR、western-blot技術檢測CD73過表達對EGFR/Akt、VEGF/Akt通路

6、活性的影響。
　　結果：
　　（1）成功構建了CD73過表達細胞模型Hela-CD73及SiHa-CD73，MTT實驗及劃痕實驗結果顯示，CD73過表達顯著促進了Hela、SiHa細胞的增殖和遷移能力。
　?。?）利用APCP處理Hela-CD73、SiHa-CD73細胞，并檢測其影響，結果顯示，APCP對Hela-CD73、SiHa-CD73細胞的增殖、遷移能力無影響，對其細胞凋亡及周期分布也無影響。
　　（3

7、）檢測腺苷對Hela、SiHa細胞的作用。結果顯示，高濃度腺苷可顯著抑制Hela、SiHa細胞的增殖，誘導細胞凋亡，并抑制其遷移能力。并且腺苷對Hela、SiHa細胞增殖的抑制效果與腺苷濃度與處理時間呈現(xiàn)正相關性。腺苷處理可以顯著提高促凋亡因子Bax、Bak和Caspase-3的表達水平，同時降低抑制凋亡因子Bcl-2的表達水平。
　?。?）CD73過表達可顯著上調EGFR、VEGF、Akt分子表達水平，而APCP并不能逆轉CD7

8、3過表達對EGFR、VEGF、Akt表達的上調作用。
　　結論：
　　通過對宮頸癌細胞系Hela、SiHa的體外實驗研究，本文的結果表明，CD73過表達可以顯著促進宮頸癌細胞的增殖和遷移能力，這種促進作用并不依賴 CD73的水解酶活性，而是與EGFR/Akt及VEGF/Akt通路活性的上調有關。由于目前針對CD73非酶功能的研究較少，因此本文研究結果有助于全面理解CD73在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的調控作用，對發(fā)掘以CD73為靶點的