miR-27b靶向調(diào)控CDH11促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和EMT的相關(guān)研究.pdf

1、前言:宮頸癌(cervical cancer)是女性常見的婦科腫瘤，在世界范圍內(nèi)，宮頸癌的致死率位居女性惡性腫瘤第四位。雖然宮頸癌的篩查已經(jīng)被廣泛普及，但是仍有大部分患者確診時位于中晚期，尤其是中國等發(fā)展中國家，而這些患者的五年生存率少于40％。值得一提的是超過三分之一的患者在經(jīng)過一期治療后，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，正是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移最終導(dǎo)致了患者的死亡。然而導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚。
　　小分子RNA(miRNAs)是一

2、類長約18-25核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它是由約70nt的前體miRNA(即pre-miRNA)經(jīng)Dicer酶剪切獲得。miRNAs通過和靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)堿基位點(diǎn)特異性配對引起目標(biāo)mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對靶基因的表達(dá)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用。據(jù)統(tǒng)計，miRNAs調(diào)控至少1/3人類基因，表明miRNAs在腫瘤致癌過程中起到重要作用。很多研究表明miRNAs的表達(dá)失調(diào)頻繁發(fā)生于人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，影響著腫瘤

3、細(xì)胞的增殖，凋亡和侵襲。一些報道表明miR-27b在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到促癌或抑癌作用。盡管如此，miR-27b在宮頸癌的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。深入研究其作用機(jī)理將為腫瘤治療提供新的策略，有望成為腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后的標(biāo)志物和基因治療的新靶點(diǎn)。
　　目的:本研究旨在探討miR-27b在宮頸癌中的表達(dá)情況、可能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制以及與宮頸癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，為臨床治療提供新的思路及依據(jù)。研究的第一部分，我們在宮

4、頸癌細(xì)胞及組織中檢測miR-27b的表達(dá)，通過生物信息學(xué)預(yù)測，檢測到miR-27b調(diào)控的下游靶基因CDH11，檢測CDH11在宮頸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)及二者的相關(guān)性，探討miR-27b潛在的臨床應(yīng)用價值;研究的第二部分，在宮頸癌細(xì)胞系中上調(diào)/下調(diào)miR-27b的表達(dá)，通過細(xì)胞功能試驗(yàn)，觀察其對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性行為的影響;檢測分析其表達(dá)改變對靶基因CDH11的調(diào)控作用;第三部分通過Western Blot方法檢測miR-27b和宮頸癌

5、在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)之間的關(guān)系，探討miR-27b使宮頸癌細(xì)胞發(fā)生增殖、侵襲的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)對象。2011年1月～2014年12月37例宮頸癌新鮮組織標(biāo)本;同期正常宮頸組織標(biāo)本37例;1株人表皮化永生細(xì)胞HaCaT，4株宮頸癌細(xì)胞HeLa，C33A，SiHa，CasKi。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法。1、細(xì)胞培養(yǎng):常規(guī)培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)

6、胞株和人永生化表皮細(xì)胞。2、莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(stem-loop Polymerase Chain Reaction，stem-loop PCR)檢測miR-27b在人宮頸癌組織、正常宮頸組織和人宮頸癌細(xì)胞系、永生化表皮細(xì)胞中的表達(dá)情況;實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitativereal-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)檢測CDH11在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá)情況。

7、3、構(gòu)建CDH11的3'-UTR野生型及突變型質(zhì)粒，與mimics NC和miR-27b mimics共轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferase)檢測熒光素酶的變化。4、選取人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、C33A，分別轉(zhuǎn)染miR-27b mimics和miR-27b inhibitor，RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功后分別應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測miR-27b的靶基因CDH11的表達(dá)情況。5、MTT法

8、檢測miR-27b對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。6、流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測miR-27b對細(xì)胞周期變化的影響。7、應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-27b對細(xì)胞侵襲能力的影響。8、應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-27b對細(xì)胞遷移能力的影響。9、Westem blot檢測miR-27b對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:第一部分miR-27b及CDH11在宮頸癌中的表達(dá)情況及二者相關(guān)性。
　　1、stem-loop PCR結(jié)果顯示

9、，miR-27b在人宮頸癌組織中的表達(dá)水平要高于其在正常宮頸組織中的表達(dá)，同時在4株宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平亦高于正常人表皮細(xì)胞。37例宮頸癌組織中miR-27b的表達(dá)量為0.244，正常宮頸組織中表達(dá)量0.199，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。2、37例宮頸癌組織CDH11的表達(dá)量為1.907，正常宮頸組織中CDH11的表達(dá)量為2.631，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。3、Pearson相關(guān)系數(shù)分析miR-27b及CDH

10、11在宮頸癌組織表達(dá)相關(guān)性，r=-0.506，呈負(fù)相關(guān)，p＜0.05。第二部分miR-27b對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其對靶基因CDH11的調(diào)控。1、生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果提示miR-27b與靶基因CDH11 mRNA的3'UTR區(qū)域169-176位點(diǎn)可形成互補(bǔ)配對結(jié)合，且該序列在多種屬間高度保守。Luciferase結(jié)果驗(yàn)證了以上miR-27b與CDH11的結(jié)合位點(diǎn)成立:與共轉(zhuǎn)染突變型CDH11-3'UTR報告基因載體相比，共轉(zhuǎn)染mi

11、R-27b和野生型CDH11-3'UTR報告基因載體時，熒光素酶活性降低(P＜0.05)。2、選取人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、C33A，分別轉(zhuǎn)染miR-27b mimics和miR-27b inhibitor，RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功后分別應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測miR-27b的靶基因CDH11的表達(dá)情況。上調(diào)miR-27b表達(dá)后CDH11在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均出現(xiàn)顯著下調(diào);下調(diào)miR-27b表達(dá)，CDH11在m

12、RNA和蛋白水平表達(dá)均出現(xiàn)顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。3、在HeLa細(xì)胞下調(diào)miR-27b的表達(dá)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力下降;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞周期阻滯于G1/S期;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞侵襲能力下降;MTT劃痕法檢測到細(xì)胞的遷移能力下降明顯。在C33A細(xì)胞中上調(diào)miR-27b的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。4、證實(shí)miR-27b通過調(diào)控靶基因CDH11從而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。在HeLa細(xì)胞共轉(zhuǎn)染inhibi

13、tor NC+siRNA NC、miR-27b inhibitor+siCDH11 NC或共轉(zhuǎn)染miR-27binhibitor+siCDH11;在C33A細(xì)胞共轉(zhuǎn)染mimics NC+vector、 miR-27bmimics+vector或共轉(zhuǎn)染miR-27b mimics+CDH11，通過western blot證實(shí)上調(diào)或下調(diào)CDH11能夠逆轉(zhuǎn)miR-27b對CDH11表達(dá)的影響。5、MMT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲除CDH11能夠顯著逆轉(zhuǎn)m

14、iR-27b inhibitor對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用;而過表達(dá)CDH11能夠顯著抑制miR-27b誘導(dǎo)的C33A細(xì)胞的增殖。6、流式細(xì)胞周期結(jié)果為上調(diào)CDH11能抑制miR-27b誘導(dǎo)的C33A細(xì)胞從G1到S期轉(zhuǎn)化;而敲除CDH11能解除miR-27b inhibitor對HeLa細(xì)胞從G1期到S期轉(zhuǎn)化的阻滯。7、劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)CDH11表達(dá)，能夠逆轉(zhuǎn)miR-27b誘導(dǎo)引起的C33A細(xì)胞的遷移和侵襲能力的增高;而

15、敲除CDH11的表達(dá)，能夠解除miR-27b inhibitor對HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲的抑制作用。第三部分miR-27b促使宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。1、Western blot檢測miR-27b對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)表達(dá)的影響。應(yīng)用miR-27b mimics上調(diào)其表達(dá)，E-cadherine表達(dá)下降，vimentin、N-cadhe

16、rin表達(dá)升高。應(yīng)用miR-27b inhibitor下調(diào)其表達(dá)，E-caderine表達(dá)升高，vimentin、N-cadherin表達(dá)下降。3、敲除miR-27b/同時敲除miR-27b和CDH11、過表達(dá)miR-27b/同時過表達(dá)miR-27b和CDH11之后，western blot檢測上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示:同陰性對照組相比，敲除miR-27b后E-cadherine表達(dá)升高，vimentin、N-cadheri

17、n表達(dá)降低;而敲除miR-27b的同時再敲除CDH11，敲除miR-27b對EMT蛋白的上述作用消失，表現(xiàn)為與陰性對照組相同的結(jié)果，即E-cadherine表達(dá)下降，vimentin、N-cadherin表達(dá)升高。同樣，過表達(dá)miR-27b后，E-cadherine表達(dá)下降，vimentin、N-cadherin表達(dá)升高;而過表達(dá)miR-27b的同時再過表達(dá)CDH11，則miR-27b的表達(dá)升高所帶來的EMT蛋白表達(dá)量的改變被逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)

18、為與陰性對照組相同的結(jié)果，即E-cadherine表達(dá)升高，vimentin、N-cadherin表達(dá)降低。
　　結(jié)論:1、與人正常上皮細(xì)胞及宮頸組織相比，miR-27b在宮頸癌細(xì)胞及組織中呈高表達(dá)，且在宮頸癌組織中miR-27b與CDH11的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。2、通過Luciferase結(jié)果證實(shí)CDH11是miR-27b的直接作用靶基因。3、miR-27b能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。4、miR-27b是通過調(diào)控靶基因CDH11