miR-19a和miR-19b對宮頸癌細(xì)胞生長的影響及其靶基因的研究.pdf

1、[研究目的]微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約18-26nt的小分子非編碼RNA，通過負(fù)性調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)水平參與多種生理、病理過程。近幾年的研究表明，許多miRNA具有癌基因或抑癌基因活性，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，在人宮頸癌組織中microRNA-19a(miR-19a)、microRNA-19b(miR-19b)是相對高表達(dá)的，本研究應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)證了這一結(jié)果，然后研究了m

2、iR-19a、miR-19b對宮頸癌細(xì)胞生長表型的影響，進(jìn)而確定miR-19a、miR-19b直接作用的共同靶基因，從而闡明miR-19a、miR-19b對宮頸癌發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮作用的可能分子機(jī)制。
　　[方法]首先應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)檢測miR-19a、miR-19b在人宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)。然后在人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中，過表達(dá)和封閉miR-19a、miR-19b，利用WST-1實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞集落形成

3、實(shí)驗(yàn)、Trasnwell實(shí)驗(yàn)等檢測細(xì)胞生長活性的變化。之后綜合利用生物信息學(xué)方法篩選出miR-19a、miR-19b的候選靶基因，并利用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-19a、miR-19b對靶基因的直接調(diào)控作用。通過Real-timePCR和Westernblot技術(shù)檢測宮頸癌細(xì)胞和宮頸癌組織中內(nèi)源性靶基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-19a、miR-19b對靶基因的調(diào)控作用。最后利用RNA干擾技術(shù)沉默靶基因，通過W

4、ST-1實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、Trasnwell實(shí)驗(yàn)等檢測細(xì)胞生長活性的變化，進(jìn)一步研究靶基因的功能。
　　[結(jié)果]Real-timePCR結(jié)果顯示miR-19a、miR-19b在人宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。在宮頸癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-19a、miR-19b后細(xì)胞增殖活性，集落形成能力，細(xì)胞的侵襲能力均增強(qiáng)；封閉miR-19a、miR-19b后表型正好相反。靶基因篩選結(jié)果表明，胰島素樣生長因子Ⅱ受體(IGF2R)

5、作為一種抑癌基因，是miR-19a、miR-19b的共同候選靶基因，其3’非翻譯區(qū)包含miR-19a、miR-19b相同的潛在結(jié)合位點(diǎn)。熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)表明，miR-19a、miR-19b能夠通過作用于IGF2R基因的3’非翻譯區(qū)(3′untranslatedregion，3′UTR)的特定位點(diǎn)，對其表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。而在miR-19a、miR-19b過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中，IGF2R基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平都有明顯下降。將I

6、GF2R基因沉默以后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞集落形成和侵襲能力也明顯增強(qiáng)。
　　[結(jié)論]miR-19a、miR-19b能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，起到癌基因的作用。IGF2R基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平都有明顯下降。將IGF2R基因沉默以后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞集落形成和侵襲能力也明顯增強(qiáng)。
　　[結(jié)論]miR-19a、miR-19b能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，起到癌基因的作用。在宮頸癌細(xì)胞中，高表達(dá)的miR-19a、