miR-630增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞惡性表型的作用與機(jī)制研究.pdf

1、宮頸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占女性生殖器官惡性腫瘤總數(shù)的半數(shù)以上。放射治療是宮頸癌的主要治療方法之一。但臨床資料顯示，宮頸癌的放療效果仍然有限。研究發(fā)現(xiàn)，輻射抗性癌細(xì)胞的存在是宮頸癌患者放療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。因此，明確調(diào)控宮頸癌輻射抵抗的關(guān)鍵分子和調(diào)控途徑，對(duì)于提高宮頸癌放療效果意義重大。多種信號(hào)通路，如NF-κB、PI3-K/Akt及TGFβ等通路，及多種關(guān)鍵分子，如HIF-1、p53、p21等，已被報(bào)道參與了宮頸癌細(xì)胞的

2、輻射敏感性的調(diào)控。宮頸癌輻射敏感性調(diào)節(jié)機(jī)制是涉及多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，目前的研究尚未完全闡明，故有待于進(jìn)一步研究。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有非常重要的作用，它被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵機(jī)制之一。EMT可使腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。因此，深入研究腫瘤發(fā)生EMT的分子機(jī)制及相關(guān)重要調(diào)控因子，并對(duì)關(guān)鍵通路的關(guān)鍵分子進(jìn)行干預(yù)，

3、理論上可以有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　microRNAs（miRNAs）是一類(lèi)新的調(diào)控因子，參與調(diào)控眾多生物學(xué)過(guò)程，在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在調(diào)控宮頸癌的輻射抗性及侵襲轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。本文從miRNA角度探尋宮頸癌輻射抵抗及侵襲轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制，以期尋找關(guān)鍵作用的miRNA分子，將其作為潛在治療靶點(diǎn)，從而提高放療療效。
　　研究目的：
　　1.建立輻射抗性

4、宮頸癌細(xì)胞株并篩選抗性細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs。
　　2.驗(yàn)證miR-630對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞輻射抗性的調(diào)控作用。
　　3.研究miR-630對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞EMT的影響。
　　研究方法：
　　1.模擬臨床腫瘤放射治療的分割療法，2Gyγ射線(xiàn)連續(xù)照射宮頸癌Hela、Siha細(xì)胞建立輻射抗性宮頸癌細(xì)胞株。miRNA芯片技術(shù)篩選輻射抗性細(xì)胞與親本細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs。
　　2.人宮頸癌Hela

5、細(xì)胞分別經(jīng)不同劑量的Co60γ射線(xiàn)照射，借助qRT-PCR檢測(cè)輻照后Hela細(xì)胞中miR-630的表達(dá)水平。Hela細(xì)胞經(jīng)6Gyγ射線(xiàn)照射后不同時(shí)間點(diǎn)，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-630的表達(dá)水平。
　　3.制備miR-630的慢病毒表達(dá)載體，包括上調(diào)miR-630的載體Lentivirus-hsa-miR-630，下調(diào)miR-630的載體Lentivirus-hsa-miR-630-inhibition，以及空載體Lentiv

6、irus-negative control，并感染Hela細(xì)胞，利用Puromycin進(jìn)行穩(wěn)定感染細(xì)胞篩選。通過(guò)qRT-PCR鑒定調(diào)變miR-630表達(dá)的Hela細(xì)胞株。
　　4.以調(diào)變miR-630表達(dá)的Hela細(xì)胞作為研究模型，采用6Gy和8Gyγ射線(xiàn)照射，借助MTT法檢測(cè)輻照后3、5、7天的細(xì)胞活性；利用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞輻照后的細(xì)胞克隆形成能力；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)自發(fā)凋亡及輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；并利用Western Blo

7、t檢測(cè)細(xì)胞輻照前后凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2，Caspase3，Caspase7及Caspase9的表達(dá)水平。
　　5.移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察調(diào)變miR-630表達(dá)的Hela細(xì)胞株的致瘤性。
　　6.借助劃痕實(shí)驗(yàn)，RTCA細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，來(lái)觀察miR-630調(diào)變對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響，采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Cytokeratin及N-

8、cadherin在miR-630調(diào)變表達(dá)的Hela細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　7.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-630的靶基因。
　　8.不同乏氧條件處理宮頸癌Hela細(xì)胞后通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-630的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.成功建立輻射抗性宮頸癌細(xì)胞株Hela-R11及Siha-R15，在輻射抗性細(xì)胞中miR-630表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2.輻射可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-6

9、30表達(dá)上調(diào)，并具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。
　　3.成功建立穩(wěn)定調(diào)變miR-630的宮頸癌Hela細(xì)胞株。
　　4.miR-630可增強(qiáng)輻射后宮頸癌Hela細(xì)胞的活性及克隆形成能力，降低細(xì)胞的自發(fā)凋亡及輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，miR-630亦可增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，同時(shí)抑制促凋亡蛋白Bax,Caspase3,Caspase7 and Caspase9表達(dá)。
　　5.miR-630可增強(qiáng)宮頸癌Hela細(xì)胞的致瘤性。

10、>　　6.miR-630可增強(qiáng)Hela細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)通過(guò)降低上皮標(biāo)志物E-cadherin和Cytokeratin的表達(dá)、升高間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)EMT發(fā)生。
　　7.miR-630對(duì)ZNF-451和IGF1R基因無(wú)直接調(diào)控作用。
　　8.乏氧可快速誘導(dǎo)Hela細(xì)胞中miR-630表達(dá)上調(diào)，并長(zhǎng)時(shí)間維持miR-630的高表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　輻射和乏氧可誘導(dǎo)miR-630在宮頸