miR-218與宮頸癌惡性程度的相關(guān)性及其作用機制的初步探究.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第二位，僅次于乳腺癌，每年約有超過50萬新發(fā)病例。2007年有25萬人因此喪生，其中80％的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。中國每年約有新發(fā)病例13.15萬，占世界新發(fā)病例的30％。近年來，宮頸癌的發(fā)病年齡趨向年輕化，成為嚴重威脅中青年婦女健康的重大婦科腫瘤之一。
　　 通過大量的臨床、分子生物學及流行病學研究，人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)已被

2、證實是引起宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的主要病因。女性中HPV感染非常普遍，多數(shù)可自然清除，僅少數(shù)持續(xù)性感染，并可發(fā)展為CIN，最終進展為浸潤性宮頸癌。宮頸癌主要的病理類型有宮頸鱗癌和腺癌，HPV16與宮頸鱗癌有關(guān)，HPV18與宮頸腺癌有關(guān)，但宮頸癌發(fā)生的具體分子機制尚不明確。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA完全或不完全互補配對，導致靶基因降解或抑制

3、其翻譯，從而在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。miRNA參與了動植物許多復雜的生命過程，包括發(fā)育、器官形成、凋亡和細胞增殖等。研究表明，miRNAs表達異常與惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，miRNAs很可能是一類潛在的癌基因或抑癌基因。最近有研究(1)發(fā)現(xiàn)HPV16陽性的細胞系、宮頸損傷和宮頸癌組織與正常宮頸組織、HPV陰性的宮頸癌細胞系相比，miR-218的表達存在差異，提示miR-218的表達失衡可能參與了宮頸癌的發(fā)病過程。目前國內(nèi)外尚無m

4、iR-218與宮頸癌惡性程度相關(guān)性的報道，而且文獻報道的miR-218在宮頸癌中的表達只檢測了HPV16陽性細胞株和少數(shù)幾例宮頸癌標本，并且這種檢測只是局限于組織中。而血清作為生物檢測樣本，具有取材方便，無創(chuàng)傷性，可連續(xù)體外檢測的優(yōu)點，且血清miRNA的高度穩(wěn)定性也使得病人的實際值與實驗的測試值相當吻合。因此有必要深入開展miR-218在宮頸癌中的表達和功能研究，以及對血清中的表達進行檢測，為深入研究宮頸癌的發(fā)病機理、早期診斷和治療提供

5、一種新的理論與實驗基礎(chǔ)。
　　 基于此，本課題的研究內(nèi)容包括以下兩部分：
　　 第一部分:miR-218的表達水平與宮頸癌惡性程度的相關(guān)性
　　 背景和目的：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在15種致癌性HPV病毒中，HPV16最為常見，HPV16陽性宮頸癌在所有宮頸癌中所占比例超過了50％。與正常宮頸組織、HPV陰性的宮頸癌細胞系相比，HPV16陽性的宮頸癌細胞系、宮頸損傷和宮頸癌組織中miR-218

6、特異性低表達。在本研究中，我們檢測了正常宮頸組織、宮頸癌細胞系、癌前病變和宮頸癌中miR-218的表達狀況，檢測了宮頸癌患者血清中miR-218的表達水平，旨在探討miR-218的降低程度與感染的HPV型別、宮頸癌惡性程度的關(guān)系，探討宮頸癌組織和血清中miR-218表達水平的相關(guān)性，以及探討血清中miR-218的表達水平能否反映宮頸癌的惡性程度，為以后的早期診斷提供一種實驗基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：本研究收集了22例子宮肌瘤患者

7、的正常宮頸組織作為對照組，收集了78例宮頸癌患者手術(shù)標本、22例石蠟包埋標本和18例宮頸癌患者的血清標本作為實驗組，檢測了miR-218在正常宮頸組織、宮頸癌細胞系、癌前病變和宮頸癌中的表達，采用導流雜交法檢測了感染的HPV的型別，探討了miR-218的表達水平與HPV型別、宮頸癌惡性程度的相關(guān)性。對于收集到的部分宮頸癌患者的血清標本，我們分離得到了小分子RNA，檢測了miR-218的表達，使用Pearson's相關(guān)系數(shù)描述了組織和血清

8、中miR-218表達水平的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.我們成功建立了檢測miR-218表達的實時定量RT-PCR方法(UPL法)，確定了其檢測的線性范圍。
　　 2.驗證了HPV16陽性細胞系SiHa中miR-218的低表達。檢測到在HPV18陽性的細胞系HeLa中，miR-218也呈低水平表達。
　　 3.高危型HPV感染的組織標本中miR-218表達低于低危型組織標本和對照組標本，低危型感染組與

9、對照組中miR-218表達水平的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 4.在正常組織、CIN和宮頸癌中，miR-218由高到低依次是：正常組織>CINI>CINⅡ～Ⅲ>宮頸癌；而且，miR-218在宮頸癌患者血清中也呈低水平表達，與組織中的低表達存在相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.HPV18(+)的宮頸癌細胞系HeLa中miR-218呈低水平表達。
　　 2.宮頸癌和癌前病變中，高危型HPV感染組織中miR-218

10、呈低水平表達。
　　 3.隨著宮頸癌惡性程度的升高，miR-218的表達水平呈進行性降低，這種降低可以反映在血清中。
　　 第二部分:miR-218在宮頸癌發(fā)病機制中作用的初步探討
　　 背景和目的：miR-218與宮頸癌的惡性程度密切相關(guān)，但在宮頸癌發(fā)病機制中所起的作用尚不清楚。本研究在體外人為改變宮頸癌細胞株中miR-218的表達，檢測其對細胞生物學活性的影響，并初步探討其影響機制。
　　 材料和方法

11、：在脂質(zhì)體siPORT NeoFX的介導下，將Pre-miR miRNA Precursor、Anti-miR miRNA Inhibitors以及對應的陰性對照分別轉(zhuǎn)染入C-33a、SiHa和HeLa細胞株中，檢測不同時間點miR-218表達水平的改變，用MTT、流式細胞術(shù)檢測其對各組細胞的增殖、凋亡、細胞周期的影響，用RT-PCR方法檢測了PI3K調(diào)節(jié)亞單位p85 mRNA的表達，并用Western blotting檢測了轉(zhuǎn)染前后p

12、85，Akt及p-Akt的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.我們成功地將miR-218轉(zhuǎn)染入SiHa細胞，轉(zhuǎn)染后24小時，miR-218水平改變最為顯著，隨時間的延長，逐漸趨向正常水平。
　　 2.在轉(zhuǎn)染后的24小時，miR-218水平升高可促進SiHa、HeLa細胞增殖，抑制細胞凋亡；miR-218水平降低可抑制SiHa、HeLa的增殖，對細胞凋亡有促進傾向，但無統(tǒng)計學意義。在轉(zhuǎn)染后的48，72小時，這種促進或抑

13、制作用消失。miR-218表達水平的改變對SiHa、HeLa細胞的細胞周期均無影響。對于C-33a，miR-218的表達水平改變對其增殖、凋亡和細胞周期均無影響。
　　 3.miR-218水平升高可促進PI3K調(diào)節(jié)亞單位p85a蛋白的表達和下游效應蛋白Akt的磷酸化，反之抑制p85蛋白的表達和Akt的磷酸化，對p85αmRNA的表達無影響。
　　 結(jié)論：雖然miR-218隨著宮頸癌惡性程度的升高而表達降低，但是體外實驗表

14、明升高miR-218的表達水平對腫瘤細胞系SiHa、HeLa的生長表現(xiàn)出促進作用，降低miR-218的表達對SiHa、HeLa的生長表現(xiàn)出抑制作用，而且只有當miR-218處于高濃度時才表現(xiàn)出這些作用，這說明miR-218對腫瘤細胞作用的復雜性，需要進一步進行體內(nèi)實驗才能充分體現(xiàn)出它的作用。
　　 本研究的創(chuàng)新點:
　　 1.本研究證實了miR-218的表達水平與感染的HPV型別、宮頸癌惡性程度密切相關(guān)，而且這種相關(guān)性可