miR-218對(duì)膠質(zhì)瘤抑瘤作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]microRNA-218(miR-218)是一種重要的抑瘤微小RNA(miRNA)，其表達(dá)異?？梢娪诙喾N實(shí)體腫瘤及癌前病變。本室前期研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤miR-218表達(dá)水平隨其良惡性程度升高而相應(yīng)降低，提示其表達(dá)減少或缺失可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)是miR-218的潛在靶基因，且膠質(zhì)瘤CDK6表達(dá)水平隨其良惡性程度升高而相應(yīng)增加，但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中二者表達(dá)變化的確切關(guān)系

2、如何，尚待進(jìn)一步證實(shí)。本研究旨在觀察miR-218在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞成熟分化方面的作用，證實(shí)CDK6是否miR-218的天然靶基因，探討miR-218特異性敲低CDK6表達(dá)是否是該miRNA發(fā)揮抑瘤作用的分子機(jī)制。
　　[方法]①通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和G418篩選建立過表達(dá)miR-218的U87MG和SNB-19亞細(xì)胞系及對(duì)照亞細(xì)胞系，采用stem-loopqRT-PCR比較各亞細(xì)胞系中miR-218的表達(dá)水

3、平。②采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR及Westernblot驗(yàn)證CDK6是否是miR-218的天然靶基因，探討miR-218敲低CDK6表達(dá)的機(jī)制。③利用Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)染色及克隆形成實(shí)驗(yàn)比較各亞細(xì)胞系細(xì)胞增殖活性，通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK4、CDK6等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的Westernblot檢測(cè)比較各亞細(xì)胞系細(xì)胞周期分布情況，分析miR-218誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和增殖抑制

4、的分子機(jī)制。④通過Caspase3/7活性檢測(cè)及FCM比較miR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系及miR-218mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡水平的改變，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染補(bǔ)充外源性CDK6，觀察CDK6對(duì)miR-218促凋亡作用的影響，以進(jìn)一步驗(yàn)證miR-218特異性下調(diào)CDK6表達(dá)在其促凋亡作用中的意義。⑤利用體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、Matrigel3D培養(yǎng)及定量侵襲實(shí)驗(yàn)比較miR-218表達(dá)水平不同亞細(xì)胞系遷移侵襲能力的差異，通過補(bǔ)充外源性CDK6探討特異性

5、敲低CDK6是否是miR-218抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的分子機(jī)制。⑥利用Westernblot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)不同亞細(xì)胞系CD133、Nestin及GFAP表達(dá)的差異，觀察miR-218在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)成熟分化中的作用；利用免疫熒光觀察miR-218下調(diào)CD133及Nestin表達(dá)的特異性；通過觀察補(bǔ)充外源性CDK6對(duì)miR-218促分化作用的影響探討特異性敲低CDK6是否是miR-218促進(jìn)腫瘤細(xì)胞成熟

6、分化的分子機(jī)制。
　　[結(jié)果]①成功構(gòu)建了過表達(dá)miR-218的U87MG及SNB-19膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞細(xì)胞系，并經(jīng)stem-loopqRT-PCR證實(shí)其miR-218的表達(dá)量分別是對(duì)照亞細(xì)胞系的11.58±2.39倍及26.23±8.08倍。②熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-218可通過與熒光素酶mRNA下游連接的CDK63’UTR結(jié)合，特異性降低熒光素酶的表達(dá)水平，證實(shí)CDK6是miR-218的天然靶基因；qRT-PCR及West

7、ernblot結(jié)果顯示，miR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系CDK6mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照亞細(xì)胞系。③miR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系Ki-67陽性標(biāo)記指數(shù)(LI)和克隆形成效率均明顯低于對(duì)照亞細(xì)胞系，其cyclinD1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照亞細(xì)胞系，cyclinE、cyclinA表達(dá)水平明顯低于后者，而CDK4的表達(dá)水平無明顯差異；FCM結(jié)果顯示，miR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系G1期細(xì)胞比例增高，而S期及G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少。④m

8、iR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系Caspase3/7活性明顯高于對(duì)照亞細(xì)胞系，miR-218mimics轉(zhuǎn)染的U87MG及SNB-19細(xì)胞其凋亡指數(shù)明顯高于無義對(duì)照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞。外源性CDK6不能降低miR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系的Caspase3/7活性及miR-218mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡指數(shù)。⑤遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果及3D培養(yǎng)結(jié)果均顯示，miR-218可有效抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲能力，外源性CDK6可部分逆轉(zhuǎn)miR-218對(duì)腫

9、瘤細(xì)胞遷移侵襲的影響。⑥miR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系中CD133及Nestin表達(dá)水平明顯低于對(duì)照亞細(xì)胞系，而GFAPLI明顯高于后者。外源性CDK6可部分逆轉(zhuǎn)miR-218過表達(dá)造成的上述蛋白的表達(dá)變化；免疫熒光檢測(cè)顯示，CD133和Nestin表達(dá)降低特異性地發(fā)生于成功轉(zhuǎn)染miR-218表達(dá)質(zhì)粒且表達(dá)EGFP報(bào)導(dǎo)基因的腫瘤細(xì)胞。
　　[結(jié)論]①本研究建立的miR-218過表達(dá)亞細(xì)胞系可穩(wěn)定高表達(dá)miR-218。②CDK6是mi

10、R-218的天然靶基因，miR-218可通過降解其mRNA和阻斷其翻譯過程在轉(zhuǎn)錄后和翻譯兩個(gè)水平特異性敲低CDK6的表達(dá)。③CDK6是易化惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞G1/S過渡的重要激酶，miR-218可通過敲低CDK6表達(dá)誘導(dǎo)G1期阻滯，并進(jìn)而抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性。④miR-218可誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，但該作用與其阻斷CDK6表達(dá)無關(guān)。⑤miR-218可有效抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，CDK6表達(dá)下調(diào)是miR-218抑制遷移侵襲