MiR-218下調(diào)Slit2-Robo1通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分人腦膠質(zhì)瘤中miR-218和Robo1的表達(dá)及意義
　　目的：探討人腦膠質(zhì)瘤miR-218和Robo1的表達(dá)及意義。
　　方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織Ⅰ和Ⅱ級(jí)10例、Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織各10例和行內(nèi)減壓的正常腦組織10例的miR-218表達(dá),Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Slit2和Robo1蛋白的表達(dá)水平,分析miR-218與Slit2-Robo1通路的相關(guān)性。

2、　　結(jié)果：相對(duì)于正常腦組織,RT-PCR結(jié)果提示miR-218在Ⅰ、Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)減少(P<0.05),在Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯減少(P<0.01);Slit2在正常腦神經(jīng)元中顯著表達(dá),而在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平降低,并且隨著腫瘤惡性程度的增高,其表達(dá)依次降低。然而Robo1的表達(dá)與之相反,其不僅在正常腦神經(jīng)元中有表達(dá),在各級(jí)膠質(zhì)瘤組織都表達(dá)增高。
　　結(jié)論：膠質(zhì)瘤組織中miR-218表達(dá)明顯減少,Slit2在膠質(zhì)瘤組織

3、中表達(dá)同樣減少,與miR-218表達(dá)呈正相關(guān),Robo1在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)異常增加,與miR-218表達(dá)呈負(fù)相關(guān),三者的表達(dá)水平對(duì)評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤良惡性程度有重要參考價(jià)值。
　　第二部分miR-218通過(guò)下調(diào)Slit2-Robo1通路抑制U251的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移
　　目的：研究上調(diào)人腦膠質(zhì)瘤系U251中miR-218的表達(dá)對(duì)Slit2-Robo1通路的影響及可能的機(jī)制。
　　方法：將miR-218的類似物mimics(

4、miR-218 mimics)或NC的類似物mimics(mimics NC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞,設(shè)一組不做任何轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照,qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)miR-218的預(yù)測(cè)靶基因Slit2-mRNA、Robo1–mRNA和蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布變化,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)體內(nèi)條件下腫瘤生長(zhǎng)能力變化,應(yīng)用Transwell小室體外侵襲和遷徙實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體外侵襲和遷移能

5、力改變。應(yīng)用雙熒光素酶分析方法鑒定miR-218和Robo1 3'UTR的表達(dá)調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　結(jié)果：U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-218 mimics成功后miR-218表達(dá)增加;Slit2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中同樣表達(dá)增加,而Robo1表達(dá)顯著下降。miR-218顯著減弱U251增殖能力,流式細(xì)胞周期檢測(cè)提示U251出現(xiàn)了G0/G1期阻滯,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體內(nèi)條件下腫瘤生長(zhǎng)能力顯著減弱。Transwell實(shí)驗(yàn)提示miR-218抑制U251膠質(zhì)瘤

6、細(xì)胞的體外侵襲及遷移能力。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示miR-218通過(guò)直接與Robo1 mRNA 3'UTR結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)其表達(dá)。
　　結(jié)論：miR-218表達(dá)可下調(diào)Slit2-Robo1通路抑制U251細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力;miR-218的生物效應(yīng)可能與調(diào)節(jié)潛在靶基因Robo1有關(guān)。
　　第三部分miR-218通過(guò)調(diào)節(jié)Robo1基因抑制U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移
　　目的：探討miR-218通過(guò)調(diào)節(jié)Robo1基因抑

7、制U251細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　方法：用siRobo1下調(diào)Robo1在U251中的表達(dá),實(shí)驗(yàn)分四組：
　?、倏瞻讓?duì)照組;
　?、趍iR-218 mimics組;
　?、跼obo1 siCont組;
　　④Robo1 siRNA組。
　　Western blot分別檢測(cè)miR-218的預(yù)測(cè)靶基因Robo1蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布變化,應(yīng)用Tr

8、answell小室體外侵襲和遷徙實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力改變。
　　結(jié)果：與空白對(duì)照組和Robo1 siCont組比較miR-218 mimics和Robo1 siRNA組Robo1蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01),Robo1 siRNA組與miR-218 mimics組Robo1蛋白表達(dá)水平相當(dāng),無(wú)顯著差異(P>0.05)。MTT結(jié)果提示Robo1 siRNA組和miR-218 mimics組U251增殖能力顯

9、著減弱,流式細(xì)胞周期檢測(cè)提示Robo1 siRNA組和miR-218 mimics組U251出現(xiàn)了G0/G1期阻滯。Transwell實(shí)驗(yàn)提示Robo1 siRNA組和miR-218 mimics組顯著抑制U251體外侵襲及遷移。下調(diào)Robo1的表達(dá)引起U251的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期G0/G1期阻滯和體外侵襲及遷移效應(yīng)與上調(diào)miR-218在U251細(xì)胞的表達(dá)引起的效應(yīng)類似,且效果相當(dāng)。
　　結(jié)論：miR-218通過(guò)對(duì)其下游靶基因