PTPH1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響及機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤。證據(jù)表明，癌癥易于復(fù)發(fā)、難以根治的重要原因是腫瘤細(xì)胞不可控制的生長和高侵襲性。因此闡明神經(jīng)膠質(zhì)瘤過度增殖和高侵襲轉(zhuǎn)移特性的分子機(jī)制，將有助于開發(fā)治療膠質(zhì)瘤的新靶點，從而改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。
　　蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，又被稱為酪氨酸-蛋白質(zhì)磷酸酶非受體類型3(PTPN3)，是PTP家族的一員，由PTPN3基因編碼，定位于第9號染色體，轉(zhuǎn)錄mRNA產(chǎn)物全長6599bp，編碼8

2、68個氨基酸，含有一個C末端的PTP結(jié)構(gòu)域、一個PDZ結(jié)構(gòu)域和一個N末端結(jié)構(gòu)域同源的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白超家族頻帶4.1結(jié)構(gòu)。研究表明PTPH1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。例如，在膽管細(xì)胞癌中，外顯子測序發(fā)現(xiàn)PTPH1基因存在突變，而且過表達(dá)PTPH1能夠促進(jìn)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力和侵襲遷移能力。在食管癌和乳腺癌臨床樣本中，PTPH1呈現(xiàn)高表達(dá)，而且其表達(dá)與乳腺癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PTPH1通過作用

3、于多種底物發(fā)揮其磷酸酶活性，從而在細(xì)胞行為中起到一定的作用，目前檢測到的底物包括腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶，T細(xì)胞受體ら亞基，維生素D受體，雌激素受體等等。然而，PTPH1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)和功能目前尚未報道，本課題旨在檢測膠質(zhì)瘤患者臨床樣本中PTPH1的表達(dá)水平，并分析PTPH1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移中的作用及其分子機(jī)制，從而為膠質(zhì)瘤治療提供新的藥物作用靶點。
　　目的：
　　1.檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床組織樣本PTPH1的

4、表達(dá)情況。
　　2.驗證基因敲低PTPH1表達(dá)的效率。
　　3.研究PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　4.分析PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期分布的影響。
　　5.探討PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　6.研究PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞成瘤能力的影響。
　　7.分析PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。
　　8.探究PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響。
　　

5、9.研究PTPH1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和遷移的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中PTPH1表達(dá)
　　本研究前期收集了15例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者配對的癌旁組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，采用real time PCR技術(shù)檢測PTPH1基因的表達(dá)情況。后期我們采集了2013-2015年在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院進(jìn)行膠質(zhì)瘤切除術(shù)的患者腫瘤組織樣品，并按WHO分級分別監(jiān)測PTPH1表達(dá)情況，監(jiān)測13例膠質(zhì)瘤Ⅱ級、13例膠質(zhì)瘤Ⅲ級、13

6、例膠質(zhì)瘤Ⅳ級、以及4例正常腦組織切片中的PTPH1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了免疫組化檢測。
　　2.PTPH1基因干擾效率
　　設(shè)計并合成PTPH1特異性shRNA和scramble shRNA，構(gòu)建慢病毒載體，并包被病毒質(zhì)粒，病毒質(zhì)粒用綠色熒光(GFP)標(biāo)記，用以感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87或U251細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察感染情況，然后采用real time PCR檢測空白對照組、scrambled shRNA組和PTPH1基因特異性s

7、hRNA組U87和U251細(xì)胞中PTPHlmRNA水平表達(dá)情況。最后再用Western blot測定空白對照組、scrambled shRNA組和PTPH1基因特異性shRNA組U87和U251細(xì)胞中PTPH1的蛋白表達(dá)水平。
　　3.PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響
　　將生長狀態(tài)良好的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87或U251，按照1×106/孔的密度接種到96孔板中，每組設(shè)計3個復(fù)孔，采用CCK-8方法檢測細(xì)胞活力;取生長狀態(tài)良好的U

8、87或者U251細(xì)胞接種到6孔板，每組設(shè)計3個復(fù)孔，調(diào)整細(xì)胞密度為100個/孔，用結(jié)晶紫染色液對形成的細(xì)胞克隆染色，并在光鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)目。
　　4.PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期分布的影響
　　取對數(shù)生長期的U87或U251細(xì)胞，用預(yù)冷70％乙醇處理細(xì)胞，加PI試劑，采用流式細(xì)胞儀檢測不同細(xì)胞周期細(xì)胞比例。
　　5.PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　取對數(shù)生長期的U87或U251細(xì)胞，收集并定量

9、蛋白，采用western blot檢測CDK2和cyclinB1蛋白表達(dá)強(qiáng)度。
　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中PTPH1表達(dá)
　　我們首先檢測了神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中PTPH1的表達(dá)情況。前期我們收集了15例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者配對的癌旁組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，并采用熒光定量PCR技術(shù)檢測PTPH1基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，PTPH1在15例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者癌旁組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中均有所表達(dá);和癌旁組織相比，PTPH1

10、在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平顯著上升（約3.5倍），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P＜0.01)。后期我們按照WHO分級再次分別對13例膠質(zhì)瘤Ⅱ級、13例膠質(zhì)瘤Ⅲ級、13例膠質(zhì)瘤Ⅳ級、以及4例正常腦組織切片中的PTPH1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了免疫組化檢測。結(jié)果顯示，在各個級別膠質(zhì)瘤中都極易檢測到PTPH1的表達(dá)，且隨著級別升高，PTPH1表達(dá)顯著升高，而在正常腦組織中，PTPH1表達(dá)則顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(P＜0.01)。
　　2.PTPH

11、1基因干擾效率
　　我們通過包被慢病毒的方法將PTPH1基因特異性shRNA(Lv-shPTPH1)轉(zhuǎn)染進(jìn)入U87和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，同時轉(zhuǎn)染scrambled shRNA作為實驗對照組(Lv-shCon)，同時還設(shè)置了空白對照組。結(jié)果顯示，95％以上的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞均成功感染攜帶Lv-shCon和Lv-shPTPH1的病毒質(zhì)粒。和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染scrambled shRNA的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞

12、中PTPH1的mRNA表達(dá)水平幾乎沒有變化;和scrambled shRNA對照組相比，轉(zhuǎn)染Lv-shPTPH1的U87和U251細(xì)胞中PTPH1的mRNA表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)。此外，轉(zhuǎn)染Lv-shPTPH1的U87和U251細(xì)胞中PTPH1蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　3.PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響
　　3.1和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染scrambled shRNA的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期沒有

13、顯著差別。然而，干擾PTPH1基因的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞數(shù)量占所有細(xì)胞數(shù)量的比例減少18％，S期細(xì)胞數(shù)量占所有細(xì)胞數(shù)量的比例增加9％。此外，干擾PTPH1基因表達(dá)同樣引起U251細(xì)胞周期S期阻滯。
　　3.2和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染scrambled shRNA的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDK2和cyclinB1蛋白表達(dá)沒有顯著差別;PTPH1基因敲低后導(dǎo)致U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDK2和cyclinB1蛋白表

14、達(dá)明顯下調(diào)。
　　3.3在細(xì)胞培養(yǎng)的前兩天，空白對照組、scrambled shRNA組和Lv-shPTPH1組細(xì)胞活力沒有明顯差別;當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第3天，干擾PTPH1導(dǎo)致U87和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力分別下降46％和18％;并且從第3天開始，U87和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力持續(xù)下降（P＜0.01或者P＜0.05）;當(dāng)培養(yǎng)到第5天，PTPH1干擾后的U87和U251細(xì)胞活力分別是對照組細(xì)胞活力的45％和76％?？寺⌒纬蓪嶒烇@

15、示，PTPH1干擾導(dǎo)致U87和U251細(xì)胞數(shù)量分別下降73.5％和80.7％。
　　3.4當(dāng)小鼠飼養(yǎng)至第16天時，兩組小鼠在腫瘤大小方面沒有明顯區(qū)別(P＞0.05)。當(dāng)飼養(yǎng)至第20天時，注射干擾PTPH1表達(dá)的U87細(xì)胞的小鼠的腫瘤體積縮小14.3％，并且腫瘤縮小的趨勢隨著飼養(yǎng)時間的增加愈加明顯。此外，干擾PTPH1表達(dá)導(dǎo)致腫瘤重量明顯下降。
　　4.PTPH1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響
　　Transwell侵

16、襲及遷移實驗表明，空白對照組和scrambled shRNA組中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力沒有明顯差別;和scrambled shRNA組相比，PTPH1基因敲低后U87和U251細(xì)胞侵襲及遷移能力分別下降60％和53％。Westernblot結(jié)果表明，空白對照組和scrambled shRNA組膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP9的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差別;然而，和對照組相比干擾PTPH1表達(dá)導(dǎo)致U87和U251細(xì)胞中MMP9蛋白表達(dá)水平顯著降低。

17、r>　　5.PTPH1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和遷移的分子機(jī)制
　　Western blot結(jié)果顯示，和空白對照組相比，scrambled shRNA組膠質(zhì)瘤細(xì)胞MEK磷酸化水平?jīng)]有顯著變化;干擾PTPH1導(dǎo)致U87和U251細(xì)胞中MEK的磷酸化水平明顯降低，但MEK總蛋白表達(dá)水平保持不變。此外，我們發(fā)現(xiàn)干擾PTPH1表達(dá)導(dǎo)致U87和U251細(xì)胞中MAPK的磷酸化水平顯著下調(diào)，但MAPK總蛋白水平?jīng)]有明顯變化。
　　結(jié)論：