Gab2對膠質瘤侵襲的影響與機制研究.pdf

1、膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病在所有顱內腫瘤約占40％，侵襲性高和預后差是膠質瘤的典型特征。高侵襲性會導致高復發(fā)率和高死亡率，因此迫切需要深入理解膠質瘤侵襲的分子機制，從而針對性地研究防治膠質瘤侵襲的藥物和方法，改善患者的預后。
　　 Gab2是支架蛋白DOS/Gab家族的一個成員，這個家族還包含哺乳動物的Gab1～Gab4蛋白。Gab2包含N端的PH結構域，中間富含脯氨酸的PRD基元及含多個磷酸化酪氨酸殘基的C端。

2、Gab蛋白絕大多數是間接通過Grb2介導聚集于活化的受體。在各種刺激下，Gab2發(fā)生酪氨酸磷酸化產生數個錨定位點來介導與含有SH2結構域的蛋白如PI3K的p85亞基結合。Gab2與PI3K的p85亞基的結合在PI3K-Akt-mTOR信號通路中起重要作用。
　　 近來，一系列的研究顯示Gab2與腫瘤細胞的遷移和侵襲有關。首先，Gab2被檢測到在乳腺癌細胞系與原發(fā)腫瘤中高表達。在Her2/Neu介導的沉默Gab2的小鼠模型中Gab

3、2缺乏的細胞遷移能力降低，小鼠乳腺癌發(fā)生的肺轉移也減少，提示Gab2能促進乳腺癌的轉移。其次，有研究發(fā)現卵巢癌組織中Gab2高表達，而且Gab2通過活化PI3K通路促進卵巢癌細胞的轉移。另外Gab2也高表達于惡性黑色素瘤、胃癌、肺癌及急性髓性白血病。然而，到目前為止，Gab2蛋白在膠質瘤中的表達及Gab2是否影響膠質瘤細胞的遷移和侵襲尚不明確。
　　 本研究首次檢測了Gab2在膠質瘤中的表達，探討了Gab2在膠質瘤侵襲中的作用，

4、結果提示Gab2在膠質瘤侵襲中有重要作用，可以作為判斷膠質瘤預后的有效分子指標。
　　 方法:
　　 1.組織標本:163例福爾馬林固定石蠟包埋的膠質瘤組織來源于1997年1月到2007年12月之間在濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院與濰坊市人民醫(yī)院接受腦膠質瘤手術切除的患者，其中膠質瘤Ⅰ級(pilocytic astrocytoma)23例(14.1％)，Ⅱ級48例(29.5％)，Ⅲ級52例(31.9％)，Ⅳ級40(24.5％)。所有

5、標本經10％中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水包埋，5um連續(xù)石蠟切片及HE染色，每例病理切片均經兩位病理醫(yī)師確診。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的膠質瘤分期標準對患者的詳細臨床資料進行分析。
　　 2.免疫組織化學:按照Santa Cruz公司所提供的操作步驟進行。切取5um厚的組織切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸緩沖液和微波加熱進行抗原修復，過氧化氫孵育中和組織中的過氧化氫酶，滴加羊血清封閉，加一抗37℃孵育30min后置于

6、4℃冰箱過夜。第二天加親合素結合的二抗，ABC溶液孵育，DAB染色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、干燥后封閉液封片，光學顯微鏡下觀察。
　　 3.IHS評分法評分結果:判斷由兩名經驗豐富的病理學教授，對免疫組化切片結果判斷評估。細胞質或者核內見淡黃色細顆粒顯著高于背景顏色為陽性細胞。每張切片選取5個高倍視野觀察結果。采用IHS評分法，分數可能范圍0～12。IHS分值9～12為強陽性，5～8為中度陽性，1～4為弱陽性，0為陰性。0

7、～4為低表達，5～12為高表達。
　　 4.免疫印跡實驗:組織/細胞蛋白提取:剪取適量組織并盡量剪碎，加入RIPA裂解液（含(l)mMDTT和蛋白酶抑制劑），4℃攪動裂解20min。細胞蛋白的提取則向生長鋪滿瓶底的培養(yǎng)瓶中加入1mL預冷的RIPA裂解液，冰上晃動20min。取得的蛋白裂解液13000 RPM離心10min，測定上清蛋白濃度。加適量體積的上樣緩沖液，煮沸變性。免疫印跡檢測:蛋白溶液經SDS電泳、轉膜，用含5％脫脂奶

8、粉的TBST封閉液封閉2h，β-actin作為內參照，加一抗后4℃過夜。TBST洗膜5min×3次后，加二抗并置于水平搖床搖動2h。按上述方法洗膜后加ECL并曝光。以目的蛋白條帶的灰度值與內參照蛋白條帶的灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。實驗重復3次。
　　 5.細胞培養(yǎng)與轉染:三種膠質瘤細胞U87、LN229和U251均在含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞達到60％-70％融合后按照L

9、ipofectamine2000的產品使用說明書進行質粒轉染操作。將對照小RNA干擾質粒與 Gab2特異性小 RNA干擾質粒(干擾序列#1:5'-GTGAGAACGATGAGAAATA-3';#2:5'-GATGCAGGCCTGACCTTTA-3')（購自Invitrogen公司）轉染入細胞，通過RT-PCR、Western-blot驗證干擾效率;使用含有終濃度為0.7ug/mL G418（新霉素）的培養(yǎng)基進行篩選。選擇干擾效率高的穩(wěn)定

10、轉染的單克隆細胞用于后續(xù)試驗。
　　 6.RT-PCR用TransZol Up提細胞的總RNA，用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA，逆轉錄步驟按試劑說明書進行。以此cDNA鏈為模板在梯度PCR儀上擴增出目的產物。取5uL擴增產物在2％的瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)上拍照，并分析各條帶灰度值，以β-actin為內參，每組重復做3次。
　　 7.傷口愈合實驗:將生長狀態(tài)良好的各組細胞，用10uL槍頭于培

11、養(yǎng)孔中部劃一條寬度相等的橫行細胞刮除帶，分別于12、18、24 h后分別觀察各組細胞遷移情況，經過不同的時間間隔，記錄三個固定位置處劃痕寬度的變化，即為細胞遷移距離。拍照。每組設三個復孔。
　　 8.細胞趨化運動實驗:各組細胞分別重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，將細胞懸液加入上層板中，細胞終濃度為5×105cell/mL。在趨化小室下層板中加入IGF-1(10ng/mL)。在上下層板之間加入一張孔徑為8um的預先用fib

12、ronectin包被過的濾膜。細胞培養(yǎng)3h后，用棉簽將濾膜上層細胞完全刮去，用HE染色濾膜下層細胞，顯微鏡下隨機計數5個高倍視野的細胞數，計算平均每高倍視野的穿膜細胞數，計算趨化指數。
　　 9.F-actin聚合實驗:饑餓細胞3h后以IGF-1(10ng/mL)分別刺激細胞0S、15S、30S、1min、2min、5min，4％PFA固定10min。F-actin buffer洗后加入帶有熒光的phalloidin(1∶20)

13、室溫下避光孵育60min。F-actin buffer洗后每孔加入100％甲醇900uL萃取phalloidin，離心，取上清液于酶標儀讀取數值。熒光信號進行標準化，計算F-actin的相對含量。
　　 10.Transwell小室基質膠侵襲實驗:在上、下層板之間加入一張孔徑8um的預先用人工基質膠覆蓋過的濾膜。將各組細胞加入Boyden小室上室。下室加入含IGF-1(10ng/mL)的細胞培養(yǎng)基。24h后擦去上室面的人工基底膠

14、和細胞，甲醇固定后HE染色，觀察拍照。顯微鏡下隨機計數5個高倍視野的細胞數，計算平均每高倍視野的穿膜細胞數，t檢驗比較組間差異。
　　 11.酶聯(lián)免疫吸附試驗收集各組細胞的培養(yǎng)基并過濾后測定游離的MMP-2與MMP-9的含量。用酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒測定培養(yǎng)基中MMP-2和MMP-9的表達水平，具體操作參照產品說明書。以全自動酶標儀測定每孔的光密度，每個樣品均重復測定3次，平均值作為最終結果。
　　 12.裸鼠顱內種植瘤

15、試驗:與HE染色Scr/U87及siGab2/U87細胞用不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至1×108/mL，鼠腦立體定位儀頭架固定裸鼠頭部后，以裸鼠頭部頂枕區(qū)作為穿刺點注入5μl（5×105個瘤細胞）懸液，觀察各組裸鼠生存期，并對種植瘤組織HE染色觀察種植瘤的生長與侵襲情況。
　　 13.統(tǒng)計學分析:應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，定量資料均采用均數±標準差形式表;臨床病理特征與Gab2表達的關系采用卡方檢驗;生

16、存分析采用log-rank檢驗。兩組間均數比較用獨立樣本t檢驗;三組及以上的定量資料采用One-WayANOVA，滿足方差齊性假設時，多重比較用LSD檢驗，不滿足時采用Welch校正，多重比較用Dunnett T3檢驗;涉及兩因素時，使用兩因素析因分析主效應和交互效應。以α=0.05為檢驗水準。
　　 結果:
　　 1.Gab2在腦膠質瘤中的表達:升高膠質瘤組織與癌周正常組織中Gab2相對表達量的平均值分別為0.83±0

17、.062和0.37±0.067，膠質瘤組織中Gab2表達顯著增高，t=20.432，P=0.000。同時膠質瘤細胞系U87、LN229和U251中Gab2均高表達。Gab2高表達率在低級別膠質瘤與高級別膠質瘤中分別為36.8％和62.1％，有顯著性差異，P=0.001。Gab2蛋白在不同病理級別的神經膠質瘤中的表達隨著WHO的臨床病理級別的增高亦有增高的趨勢。
　　 2.Gab2的表達與膠質瘤患者預后的關系:根據免疫組化的Gab

18、2表達結果，方差分析顯示Gab2表達水平與患者的WHO分級和生存時間顯著相關，分別為x2=10.189，P=0.001與x2=8.710，P=0.003，而與性別、年齡無顯著性相關。Log-rank生存分析發(fā)現Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤患者中Gab2的高表達水平與各級膠質瘤的低生存期顯著相關，均為P＜0.05。
　　 3.膠質瘤組織中Gab2的表達與pAkt的表達相關:腦膠質瘤組織免疫組化染色結果顯示Gab2高表達的膠質瘤組織中pAkt

19、的高表達率為75％，而Gab2低表達的膠質瘤組織中pAkt的低表達率為63.3％，通過方差分析表明，Gab2的表達與pAkt的表達呈正相關x2=24.280，P=0.000;低級別膠質瘤(Ⅰ+Ⅱ)與高級別膠質瘤(Ⅲ+Ⅳ)之間pAkt的表達有顯著性差異，x2=10.189，P=0.001。
　　 4.穩(wěn)定轉染的人膠質瘤U87，LN229和U251細胞的鑒定:RT-PCR與免疫印跡結果顯示siGab2/U87、siGab2/LN22

20、9及siGab2/U251細胞的Gab2mRNA及蛋白的表達分別比U87細胞以及對照細胞Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251均顯著降低，從而證明通過小RNA干擾得到了Gab2的表達被穩(wěn)定抑制的siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251細胞及Gab2表達與U87細胞比較無顯著改變的對照組Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251細胞。
　　 5.降低Gab2的表達抑制了膠質瘤細

21、胞的遷移能力傷口愈合:實驗結果顯示對照組Scr/U87細胞與Gab2表達減少的siGab2/U87的遷移距離（um）分別為278.222±29.269和530.556±27.758，有顯著性差異，t=18.766，P＜0.001;同樣，Scr/LN229與siGab2/LN229組細胞的遷移距離(um)分別為309.556±26.378與560.667±41.286，有顯著性差異，t=15.376，P＜0.001;Scr/U251與si

22、Gab2/U251組細胞的遷移距離（um）分別為409.889±25.487與593.333±33.982，有顯著性差異，t=12.956，P＜0.001?？梢奊ab2表達降低的細胞爬出劃痕較少，遷移距離小，而對照組細胞遷移距離較大，部分區(qū)域接近完全融合。這個結果說明Gab2表達降低后細胞的遷移能力也隨之減弱。
　　 6.降低Gab2的表達抑制了膠質瘤細胞的趨化能力:應用趨化小室的趨化運動模型，在不同濃度的IGF-1誘導3h后，

23、根據不同濃度下各組細胞的趨化能力確定最適IGF-1趨化因子濃度為10ng/mL。在最適趨化濃度下Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251細胞具有很強的趨化運動能力，可見較多細胞爬至濾膜下面;siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251細胞的趨化運動能力顯著降低，Scr/U87與siGab2/U87、Scr/LN229與siGab2/LN229、Scr/U251與siGab2/U251細胞之間比較趨化

24、能力有顯著性差異，分別為t=8.147，P=0.001;t=4.448，P=0.011; t=3.517，P=0.025。這個結果說明Gab2表達降低后細胞的趨化能力也隨之減弱。
　　 7.減少Gab2的表達降低了膠質瘤細胞的侵襲能力Transwell小室基質膠侵襲實驗:結果顯示，以10ng/mL的IGF-1作為趨化因子誘導膠質瘤細胞穿透基質膠和濾膜，Gab2表達降低的siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2

25、/U251細胞穿透基質膠和濾膜的平均數目分別為20.750±4.113、27.500±6.455、25.000±7.165，而對照組Scr/U87、Scr/LN229及Scr/U251細胞穿透基質膠和濾膜的平均數目分別為40.750±6.850、45.500±7.853、43.250±4.992，兩組細胞分別比較差異有統(tǒng)計學意義，siGab2/U87、siGab2/LN229和siGab2/U251細胞穿透基質膠和濾膜的數目顯著減少，分

26、別為t=5.007，P=0.002; t=3.541，P=0.012; t=4.180，P=0.006，說明Gab2表達降低后膠質瘤細胞的侵襲能力顯著降低。
　　 8.降低Gab2表達:減少了絲狀肌動蛋白(F-actin)的聚合在Scr/U87細胞內，IGF-1刺激15Sec和60Sec時誘發(fā)了快速肌動蛋白聚合，siGab2/U87細胞內肌動蛋白在各時間點聚合顯著減少，Scr/U87與siGab2/U87兩組之間比較有顯著性差異

27、，F=29.819，P＜0.001，Scr/U87細胞組F-actin的聚合顯著高于siGab2/U87細胞組，說明Gab2在細胞骨架重組過程中起著非常重要的作用。
　　 9.Gab2調節(jié)cofilin與LIMK1/2的磷酸化:應用Western blot方法對Scr/U87和siGab2/U87細胞IGF-1（10ng/mL）誘導下的cofilin及LIMK1/2磷酸化水平進行測定，發(fā)現IGF-1誘導下siGab2/U87細胞

28、的總cofilin和LIMK1/2的蛋白水平與Scr/U87細胞比較在各時間點均未見顯著改變，而磷酸化的p-cofilin與p-LIMK1/2在Scr/U87細胞隨著IGF-1刺激時間的延長而增多。siGab2/U87細胞隨著IGF-1刺激時間的延長磷酸化的p-cofilin與p-LIMK1/2表達未見顯著改變。IGF-1(10ng/mL)誘導后Scr/U87與siGab2/U87兩組細胞之間p-cofilin與p-LIMK1/2表達量

29、均有顯著性差異，分別為F=11.781，P=0.005; F=24.206, P＜0.001。
　　 10.Gab2的表達降低后膠質瘤細胞的MMP-2和MMP-9表達減少:酶聯(lián)免疫吸附試驗測定細胞培養(yǎng)基中游離MMP-2和MMP-9的含量，結果表明在IGF-1(10ng/mL)誘導下，Gab2降低的siGab2/U87細胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的相對含量分別為1.14±0.09和1.05±0.11，Scr/U87細胞的MM

30、P-2和MMP-9含量分別為3.36±0.38和4.09±0.19，兩組細胞之間比較有統(tǒng)計學意義，分別為F=72.853，P＜0.001;F=321.272，P＜0.001，siGab2/U87細胞培養(yǎng)液中MMP-2和MMP-9的相對含量顯著降低;Westem blot法測定各組細胞MMP-2和MMP-9的含量，IGF-1(10ng/mL)誘導后Gab2降低的siGab2/U87細胞中MMP-2和MMP-9的含量分別0.69±0.12和

31、0.27±0.09，Scr/U87細胞的MMP-2和MMP-9含量分別為1.62±0.25和0.95±0.13，siGab2/U87細胞中MMP-2和MMP-9的含量均顯著降低，與Scr/U87細胞比較有統(tǒng)計學意義，分別為F=5.840，P=0.004; F=7.706, P=0.002。
　　 11.降低Gab2的表達抑制Akt的磷酸化:應用Western blot方法分析顯示，Gab2降低的siGab2/U87細胞中IGF-

32、1誘導的磷酸化pAkt水平與對照組Scr/U87細胞比較顯著降低，兩組細胞比較有統(tǒng)計學意義，F=72.100，P＜0.001。本結果與膠質瘤組織中pAkt免疫組化表達結果相一致。
　　 12.降低Gab2的表達抑制mTOR的磷酸化:Western blot實驗發(fā)現Gab2降低的siGab2/U87細胞中IGF-1誘導的磷酸化的pmTOR水平與Scr/U87細胞比較顯著降低，兩組細胞比較有統(tǒng)計學意義，F=139.792，P＜0.0

33、01，與siGab2/U87細胞中pAkt表達結果相符合，提示Gab2的信號轉導與Akt和mTOR的磷酸化密切相關。
　　 13.荷瘤裸鼠的生存時間:Scr/U87和siGab2/U87組裸鼠的中位生存時間分別為22.5天和26.5天，log-rank檢驗顯示Gab2表達降低的siGab2/U87細胞組與對照Scr/U87細胞組比較生存時間顯著延長，兩組生存期的差別有統(tǒng)計學意義，x2=11.47，P=0.001。
　　

34、14.體內原位成瘤的侵襲性:HE染色后Scr/U87組裸鼠種植瘤周圍腦組織有較多腫瘤細胞浸潤及衛(wèi)星轉移灶形成，平均為27.00±4.04個;siGab2/U87組腦組腫瘤病理切片顯示裸鼠腦內腫瘤周圍浸潤的腫瘤細胞及衛(wèi)星轉移灶形成較少，巢狀排列不明顯，平均為12.13±2.75個。兩組間比較差別有統(tǒng)計學意義，t=8.617,P＜0.001。
　　 結論:
　　 1.Gab2在膠質瘤組織中高表達，且其表達水平與膠質瘤的WHO

35、臨床病理分級及預后顯著相關。
　　 2.pAkt的表達水平與膠質瘤的WHO臨床病理分級及Gab2的表達水平顯著相關。
　　 3.降低Gab2的表達后膠質瘤細胞的遷移能力、趨化能力與侵襲能力均顯著下降，說明Gab2與膠質瘤細胞侵襲轉移有關。
　　 4.Gab2通過調節(jié)絲狀肌動蛋白(F-actin)的聚合在細胞骨架重組過程中起著非常重要的作用。
　　 5.Gab2通過調節(jié)調節(jié)cofilin與LIMK1/2的磷

36、酸化而影響細胞肌動蛋白的聚合作用，從而調節(jié)細胞的遷移與趨化能力。
　　 6.降低Gab2表達減少了膠質瘤細胞MMP-2、MMP-9的生成，從而減弱了膠質瘤細胞的侵襲能力。
　　 7.Gab2可以通過磷酸化Akt與mTOR，即通過調節(jié)PI3K-Akt-mTOR信號通路影響膠質瘤細胞的侵襲遷移能力。
　　 8.降低Gab2在膠質瘤細胞中的表達可以減少裸鼠種植膠質瘤向周圍腦組織的侵襲，減慢膠質瘤的惡性進展，延長生存期。