Cavl不同表達(dá)對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響以及細(xì)胞外ATP對(duì)U87膠質(zhì)瘤侵襲和遷移研究.pdf

1、一、研究背景及目的：
　　 膠質(zhì)瘤(glioma)是人顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤，其生物學(xué)特性中最重要的特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞侵入到正常腦組織，圍繞在原發(fā)灶周圍形成所謂的“衛(wèi)星腫瘤灶”，而且常要侵襲腦的重要功能區(qū)，由于沒(méi)有合理的切實(shí)可行的辨認(rèn)腫瘤邊界的方法或者技術(shù)，因此一直以來(lái)手術(shù)切除腫瘤的程度很有限，而且術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的幾率隨著病理級(jí)別的升高而升高，更為可怕的是人腦膠質(zhì)瘤中的大約50%左右是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma)，它們的特性是侵

2、襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)時(shí)間短、預(yù)后差?，F(xiàn)代計(jì)算機(jī)斷層掃描、術(shù)前MRI(核磁共振)等影像技術(shù)仍難以準(zhǔn)確的確定腫瘤邊界，即使術(shù)中使用了普通顯微鏡，但是放大倍數(shù)還很有限，仍然難以辨認(rèn)腫瘤界限，而且殘留的腫瘤細(xì)胞即使僅占1mm3體積細(xì)胞數(shù)目將達(dá)到109個(gè)，因此，研究膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的機(jī)制對(duì)于臨床治療膠質(zhì)瘤患者有著重要的意義。
　　 Caveolin-1(Cav1)是細(xì)胞膜脂質(zhì)微區(qū)上的一種膜蛋白，又稱小窩蛋白，主要作用就是保持膜脂質(zhì)微區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的

3、完整，在人體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)吞、膜脂調(diào)節(jié)、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)及膽固醇代謝平衡等方面具有重要作用。近年來(lái)，Cav1在各種腫瘤的影響越來(lái)越被重視，但是它是促進(jìn)還是抑制腫瘤生長(zhǎng)仍存在很多矛盾。我們課題組前期免疫組化檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中Cav1高表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中Cav1 mRNA水平與膠質(zhì)瘤級(jí)別和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。
　　 ATP作為人體重要的能量與代謝物質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，ATP及其受體構(gòu)成的信號(hào)通路還參與了膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的增生

4、、遷移、分化及神經(jīng)元之間的相互作用過(guò)程。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外ATP的降解速度遠(yuǎn)低于膠質(zhì)細(xì)胞(9)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用和破壞也可導(dǎo)致ATP釋放，因此膠質(zhì)瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境中ATP的濃度升高；而ATP可通過(guò)激活其P2Y2受體活化G12和G0，從而促進(jìn)RhoA-Rock-MLC磷酸化，誘導(dǎo)應(yīng)力纖維形成和細(xì)胞的侵襲，但是這個(gè)過(guò)程需要P2Y2受體與αv整合素結(jié)合，若阻斷P2Y2受體與αv整合素的結(jié)合可完全抑制膠質(zhì)

5、瘤細(xì)胞的侵襲，但影響P2Y2受體與αv整合素結(jié)合的因素并不清楚。前期的研究已經(jīng)明確，整合素與多種G蛋白耦聯(lián)受體在細(xì)胞膜上主要分布于富含Cav1的脂質(zhì)微區(qū)中，與Cav1相互結(jié)合形成復(fù)合體參與多種功能，因此研究ATP對(duì)膠質(zhì)瘤的作用，以及其中Cav1的作用，可能在治療膠質(zhì)瘤上有重要的意義。
　　 本課題旨在探討惡性膠質(zhì)瘤侵襲機(jī)制的宏觀層面為出發(fā)點(diǎn)，研究了Cav1(Caveolin-1)、細(xì)胞外三磷酸腺苷(Adenosine Triph

6、osphate，ATP)在腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)和遷移中的作用。分析了Cav1不同表達(dá)在U87膠質(zhì)瘤中生長(zhǎng)和侵襲差異，從而為進(jìn)一步研究腦膠質(zhì)瘤治療提供新的思路與策略，本研究還運(yùn)用時(shí)間顯微鏡成像技術(shù)，能直觀的反映出外界因素作用于U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞定向遷移現(xiàn)象，而且用蛋白芯片技術(shù)探討了細(xì)胞外ATP作用下，細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，為進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。
　　 二、材料以及研究方法：
　　 (1)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中

7、Cav1是否為陽(yáng)性表達(dá)；
　　 (2)構(gòu)建Cav1慢病毒顆粒來(lái)上調(diào)或下調(diào)U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Cav1的表達(dá)；
　　 (3)應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Cav1過(guò)表達(dá)及干擾對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，并且應(yīng)用MTT法檢測(cè)U87人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；
　　 (4)采用細(xì)胞“劃痕”愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)方法分析Cav1上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)后，U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。
　　 (5)細(xì)胞外AT

8、P對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，用CCK-8檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)了0.1%、1％、10%血清中各濃度梯度ATP作用下對(duì)U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖情況。
　　 (6)細(xì)胞外ATP對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了不同培養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。
　　 (7)細(xì)胞外ATP對(duì)U87細(xì)胞體外侵襲的影響，實(shí)驗(yàn)采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，以相同條件下不加ATP作為對(duì)照組，以加入100

9、μmol/LATP作為處理組，經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)并處理小室，對(duì)跨膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　 (8)細(xì)胞外ATP對(duì)U87細(xì)胞遷移速度的影響，實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間顯微鏡每隔2分鐘采集照片1次，其恒溫系統(tǒng)也可以很好的保持細(xì)胞活性，觀察細(xì)胞外ATP作用下對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響。
　　 (9)細(xì)胞外ATP作用于U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平，運(yùn)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，分析了100μM ATP的10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基作用于體外培

10、養(yǎng)的U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞45 min后細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化水平變化。
　　 三、主要研究結(jié)果：
　　 1.Cav1過(guò)表達(dá)及干擾對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的影響
　　 (1)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Cav1呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　 (2)成功構(gòu)建出U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞Cav1過(guò)表達(dá)及干擾序列。
　　 (3)Cav1過(guò)表達(dá)及干擾對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。
　　 (4)劃痕試驗(yàn)表明，U87細(xì)胞在

11、含10% FBS DMEM的作用下行劃痕實(shí)驗(yàn)，Cav1干擾表達(dá)后，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移力明顯強(qiáng)于U87細(xì)胞Cav1過(guò)表達(dá)后；可是在用含有0.1% FBS培養(yǎng)基中Cav1過(guò)表達(dá)遷移力強(qiáng)于Cav1干擾表達(dá)。這說(shuō)明Cav1對(duì)腦膠質(zhì)瘤的遷移能力的作用受外界培養(yǎng)環(huán)境的影響。
　　 (5)Transwell實(shí)驗(yàn)時(shí)，在含有10% FBS培養(yǎng)基中Cav1干擾表達(dá)后，U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)Cav1后，U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力呈下降

12、(圖3)；但在含有0.1% FBS培養(yǎng)基下Cav1干擾表達(dá)后，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力卻呈降低趨勢(shì)，而Cav1過(guò)表達(dá)中，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)。這說(shuō)明Cav1對(duì)腦膠質(zhì)瘤的侵襲能力的作用受外界環(huán)境的影響。
　　 2、細(xì)胞外ATP對(duì)U87膠質(zhì)瘤的作用
　　 (1)CCK-8檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)了0.1%、1%、10%血清中各濃度梯度ATP作用下對(duì)U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外較低濃度ATP(100μM、20

13、0μM、500μM)對(duì)體外培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響，但較高濃度ATP(5000μM)對(duì)細(xì)胞呈顯著抑制作用。
　　 (2)細(xì)胞外ATP對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了不同培養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組(100μMATP)及對(duì)照組對(duì)U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期無(wú)明顯影響。
　　 (3)細(xì)胞外ATP對(duì)U87細(xì)胞體外侵襲的影響，采用Transwell侵襲

14、實(shí)驗(yàn)，表明一定濃度ATP可以顯著增強(qiáng)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。
　　 (4)細(xì)胞外ATP對(duì)U87細(xì)胞遷移速度的影響情況，實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間顯微鏡每隔2分鐘采集照片1次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中，100μmol/L的ATP可以顯著增強(qiáng)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，使其遷移增強(qiáng)。
　　 (5)細(xì)胞外ATP作用于U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平，實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)芯片分析了與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化水平。100μM細(xì)胞外ATP作用于體

15、外培養(yǎng)的U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞45min后VASP(Ab-238)和Rac1/cdc42(Ab-71)信號(hào)通路活化
　　 四、結(jié)論
　　 本課題研究了Cav1在U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲中的作用；以及細(xì)胞外ATP對(duì)U87人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用；建立了細(xì)胞外ATP作用下直觀觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的系列裝置，觀察了細(xì)胞外ATP對(duì)體外培養(yǎng)的U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響。結(jié)論如下：
　　 Cav1在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

16、顯著增高，Cav1的表達(dá)越高，病人的預(yù)后越差；Cav1對(duì)U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖無(wú)任何作用。
　　 2、Cav1在U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增中呈陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移中的作用具有細(xì)胞差異并受腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的影響。在細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，Cav1過(guò)表達(dá)抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。在營(yíng)養(yǎng)相對(duì)缺少的情況下，Cav1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。
　　 3、細(xì)胞外較低濃度ATP(100μM、200μM、50

17、0μM)對(duì)體外培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響，但較高濃度ATP(5000μM)對(duì)細(xì)胞呈顯著抑制作用。
　　 4、細(xì)胞外ATP(100μM)可以顯著增強(qiáng)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。
　　 5、運(yùn)用時(shí)間顯微鏡及觀察裝置，可以直觀看出細(xì)胞外一定濃度ATP(100μM)可以增強(qiáng)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。
　　 6、蛋白芯片技術(shù)表明ATP作用于U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以顯著增強(qiáng)VASP(Ab-238)和Rac1/cdc

18、42(Ab-71)信號(hào)通路活化。
　　 有研究指出膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外ATP的降解速度遠(yuǎn)低于膠質(zhì)細(xì)胞，且膠質(zhì)瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境中ATP的濃度升高；細(xì)胞外ATP濃度升高對(duì)正常腦組織有細(xì)胞毒性作用，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞不但耐受性高，而且細(xì)胞外的ATP還可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。本課題研究探討了Cav1在U87腦膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及表達(dá)情況，通過(guò)細(xì)胞外ATP對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，明確了腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的機(jī)制，蛋白芯片技術(shù)研究為進(jìn)一步探