耗竭NAD+聯(lián)合2-DG增加腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞放射敏感性及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：本課題主要通過沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞NAMPT基因（NAD+應(yīng)急合成途徑限速酶）或者外源性加入NAD+影響細(xì)胞內(nèi)NAD+含量，探討2-脫氧葡萄糖（2-DG)誘導(dǎo)的NAD+含量增加，在維持細(xì)胞能量代謝、氧化還原水平以及存活的關(guān)鍵作用機(jī)制,為進(jìn)一步在2-DG處理下耗竭細(xì)胞內(nèi)NAD+誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、放射增敏提供理論依據(jù)。
　　方法：1.在2-DG誘導(dǎo)的U87細(xì)胞代謝適應(yīng)的研究中，Western blot法觀察不同濃度2-D G培養(yǎng)條件下，N

2、 A M P T的表達(dá)以及caspase3活化的改變，使用NAD+檢測試劑盒觀察NAD+含量變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS)水平；2.在NAD+介導(dǎo)2-D G處理下的代謝適應(yīng)的研究中，小干擾RNA-NAMPT(siNAMPT)或外源性加入NAD預(yù)處理U87細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測DCFH染色的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，NADPH試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)NADPH水平；再聯(lián)合2-DG處理?xiàng)l件下，A T P試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)A T P含量變化，流式細(xì)胞

3、儀檢測Annexin-V或P I染色后U87細(xì)胞凋亡變化，Western b lo t法觀察caspase3活化情況；3.在耗竭NAD+聯(lián)合2-D G增加膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞殺傷研究中，使用小干擾RNA-NAMPT(siNAMPT)或雜亂RNA轉(zhuǎn)染 U87細(xì)胞再聯(lián)合2-DG處理，流式細(xì)胞儀檢測Annexin-V-FITC以及P I雙染的細(xì)胞陰性水平。4.在耗竭NAD+聯(lián)合2-D G增加膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞放射敏感性研宄中，實(shí)驗(yàn)分組為si-scr

4、amble RNA+IR、si-scramble RNA+2-DG+IR、siNAMPT+IR、siNAMPT+2-DG+IR,4Gy X射線照射，14天后，計數(shù)克隆形成水平；與克隆形成實(shí)驗(yàn)分組相同，激光共聚焦顯微鏡觀察YH2AX抗體孵育的U87細(xì)胞X線照射后0，4，10,24小時DNA雙鏈斷裂數(shù)目。
　　結(jié)果：1.單純2-D G處理?xiàng)l件下，1681611113101結(jié)果顯示1187細(xì)胞\^\^0>丁蛋白表達(dá)升髙，NAD+檢測結(jié)果

5、顯示U87細(xì)胞內(nèi)NAD+含量增加，流式細(xì)胞儀檢測U87細(xì)胞D C F H熒光強(qiáng)度減弱，同時Western b lo t結(jié)果顯示2.5，5，10 mM2-DG組相比對照組，caspase3活化水平呈濃度依賴性下降；2. ATP試劑盒檢測結(jié)果顯示2-DG處理組比對照組ATP含量顯著下降，siNAMPT+2-DG處理組比2-DG處理組ATP含量顯著下降,2-DG+exNAD處理組比2-DG處理組ATP含量上升，證明2-DG誘導(dǎo)的NAD+增加參

6、與維持細(xì)胞內(nèi)的ATP含量；流式細(xì)胞儀檢測U87細(xì)胞DCFH熒光計數(shù)，結(jié)果顯示2-DG、exNAD處理組與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)R O S含量下降超過對照組的50％; FK866、siNAMPT處理組與對照俎相比，細(xì)胞內(nèi)R O S含量上升超過對照組的25%,證明NAD+參與細(xì)胞內(nèi)ROS水平的調(diào)節(jié)； NADPH試劑盒檢測結(jié)果顯示2-DG、exNAD處理組與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)NADPH含量顯著上升；FK866、siNAMPT處理組與對照俎相比，細(xì)

7、胞內(nèi)NADPH下降，證明2-DG誘導(dǎo)的NAD+增加通過NAD+-NADPH過程參與細(xì)胞內(nèi)R O S調(diào)控。Western b lo t結(jié)果顯示2-DG、NAD+處理組比對照組cleaved caspase3表達(dá)降低，siNAMPT處理組比對照組 cleaved caspase3表達(dá)增加，siNAMPT+2-DG處理組比2-DG處理組 cleaved caspase3表達(dá)增加，siNAMPT+2-DG+exNAD處理俎比 siNAMPT+2

8、-DG處理俎降低 caspase3活化但仍然高于2-DG處理組，證明2-DG誘導(dǎo)的NAD+增加參與下調(diào)細(xì)胞內(nèi)凋亡過程；3.流式細(xì)胞儀檢測Annexin-V-FITC以及P I雙染的細(xì)胞陰性水平結(jié)果顯示siNAMPT+2-DG處理組對比si-scramble RNA+2-DG處理組在2-DG處理組細(xì)胞存活明顯下降，siNAMPT+2-DG+exNAD處理組比siNAMPT+2-DG處理組細(xì)胞存活上升但仍低于si-scramble RNA+

9、2-DG處理組。4.克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示siNAMPT+2-DG處理組的細(xì)胞比 si-scramble R N A、siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG組克隆形成顯著減少，siNAMPT+2-DG處理組放射增敏比為1.64，siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG組放射增敏比為1.30，1.23，證明耗竭 NAD+顯著增加膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞放射敏感性。激光共聚焦檢測丫H2AX染色的DNA雙鏈斷裂結(jié)果為siN

10、AMPT+2-DG組比si-scramble R N A, siNAMPT, si-scramble RNA+2-DG組在4小時、10小時時間點(diǎn)的DNA雙鏈斷裂的數(shù)目無明顯統(tǒng)計學(xué)差異；在24小時時間點(diǎn)，siNAMPT+2-DG組D N A雙鏈斷裂明顯增多，超過2-DG處理組的40%，si-scramble RNA組24小時的DNA雙鏈斷裂已經(jīng)基本消失，該結(jié)果提示siNAMPT+2-DG組有效影響電離輻射后D N A損傷修復(fù)進(jìn)程,增加U8