DCX表達(dá)影響腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及放射敏感性的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的U87-DCX、U87-NG細(xì)胞株
　　 目的:構(gòu)建針對(duì)DCX的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染U87-MG細(xì)胞株，通過篩選獲得DCX表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型。
　　 方法:采用UbC-GFP-L.V.慢病毒感染U87-MG細(xì)胞株，選擇感染效率高、MOI值高、對(duì)細(xì)胞毒性低為最佳感染條件，獲得U87-DCX和U87-NG細(xì)胞株，用PCR和Western Blot方法檢測(cè)。
　　 結(jié)果:U87-DCX細(xì)胞為DC

2、X過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，目的基因DCX融合GFP和FLAG共同表達(dá);Western Blot檢測(cè)到72-95KD處有陽性條帶;其大小和DCX-GFP-FLAG融合蛋白(48KDa+28KDa+2KDa=78KDa)相吻合。表達(dá)克隆中插入目的基因片段大小為1326bp。
　　 結(jié)論:U87-DCX、U87-NG細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　 第二部分:基因芯片篩選與DCX和放射相關(guān)的差異基因
　　 目的:基因芯片篩選轉(zhuǎn)染D

3、CX的U87-MG細(xì)胞在照射前后的差異基因，探討與DCX和電離輻射均具有相關(guān)性的下游基因在膠質(zhì)瘤放射治療中的作用。
　　 方法:將U87-MG細(xì)胞、U87-DCX細(xì)胞經(jīng)60Coγ射線（10Gy，劑量率1.0Gy/min）照射，用基因芯片技術(shù)篩選差異基因，均值兩兩比較，取P＜0.05的差異基因分析。
　　 結(jié)果:放射和DCX轉(zhuǎn)染均有相關(guān)性差異基因有:EIF5A、LYN、SPN;與放射相關(guān)的差異基因有:IMAA、LDHA、W

4、IBG、UBC;與DCX相關(guān)的差異基因有:PLS3、IL11、NOV。U87-MG細(xì)胞、U87-DCX細(xì)胞分別經(jīng)60Coγ射線(10Gy，劑量率1.0Gy/min)照射，選取SPN與DCX免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，U87-MG細(xì)胞照射組與對(duì)照組均無DCX和SPN蛋白表達(dá)，而U87-DCX細(xì)胞照射組與對(duì)照組DCX和SPN蛋白均表達(dá)，并且DCX和SPN的蛋白表達(dá)水平在10Gy照射組明顯高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論:表達(dá)譜基因芯片技術(shù)能快

5、速、靈敏地篩選出U87-DCX細(xì)胞在放療前后的差異基因，通過上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在放射條件下DCX蛋白表達(dá)水平增高，且與SPN相互作用。
　　 第三部分:體外試驗(yàn)研究DCX的放射作用機(jī)制
　　 目的:研究DCX基因高表達(dá)聯(lián)合γ-射線照射對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、DNA損傷修復(fù)及凋亡的影響。
　　 方法:1.U87-MG、U87-DCX、U87-NG三種細(xì)胞經(jīng)60Coγ射線照射，劑量分別為0，2，4，6，8，10Gy。

6、收集細(xì)胞提取蛋白，用Western Blot方法測(cè)定不同放射劑量的DCX蛋白量，并繪制劑量效應(yīng)曲線。2.測(cè)定DCX下游基因在不同放射劑量下的蛋白量，并繪制劑量效應(yīng)曲線。3.激光共聚焦顯微鏡觀察U87-MG、U87-DCX、U87-NG三種細(xì)胞的DCX及SPN蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4.彗星試驗(yàn)研究照射后U87-MG、U87-DCX、U87-NG三種細(xì)胞的雙鏈DNA損傷，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。5.流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。6.細(xì)胞計(jì)數(shù)方法測(cè)

7、定不同細(xì)胞的生存曲線以及劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　 結(jié)果:1.2，4，6，8，10Gy照射條件下DCX、SPN蛋白顯示表達(dá)水平較對(duì)照組高;2.DCX、SPN蛋白在胞漿內(nèi)共定位表達(dá);3.彗星試驗(yàn)表明U87-DCX細(xì)胞的尾長(zhǎng)在0、5、10Gy劑量組均較U87-MG、U87-NG細(xì)胞長(zhǎng)(P＜0.05);4.在輻射作用下，U87-DCX和U87-NG細(xì)胞的凋亡率均較低，兩者凋亡率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，U87-DCX細(xì)胞的凋亡率照射組

8、與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);6.U87-DCX細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)能力較未轉(zhuǎn)染組低。
　　 結(jié)論:電離輻射誘導(dǎo)下DCX蛋白表達(dá)水平增高，隨著照射劑量的增加蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，并且與下游基因SPN相互作用，DCX在射線所致的細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮作用;DCX能夠通過輻射誘導(dǎo)DNA損傷，證實(shí)DCX基因轉(zhuǎn)染能夠增強(qiáng)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性;細(xì)胞的放射損傷與凋亡之間無明顯相關(guān)性;轉(zhuǎn)染DCX的U87細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，缺乏侵襲能力。

9、
　　 第四部分:體內(nèi)試驗(yàn)究DCX對(duì)膠質(zhì)瘤放射敏感性的影響
　　 目的:構(gòu)建U87-DCX轉(zhuǎn)染細(xì)胞的荷瘤鼠模型，研究DCX轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，探討其放射增敏機(jī)制。
　　 方法:構(gòu)建U87-DCX和U87-NG裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位種植模型;成瘤后以60Coγ射線照射，正常組織以鉛板屏蔽，暴露頭部照射野，劑量率0.5Gy/min，單次劑量200cGy，每日一次，共五天，總劑量為10Gy。小動(dòng)物MRI評(píng)

10、估小鼠在放射治療前后的腫瘤大小;MicroPET測(cè)量裸鼠接種部位的腫瘤大小及微血管密度SUVmax值;免疫組化觀察放療前后的腦組織內(nèi)DCX和SPN表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:小動(dòng)物MRI測(cè)量結(jié)果表明U87-DCX實(shí)驗(yàn)組放療后腫瘤體積比U87-NG實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積縮小明顯。MicroPET顯示經(jīng)過放射治療的裸小鼠SUVmax值較放療前明顯下降，其中DCX轉(zhuǎn)染組的裸小鼠下降更為明顯，均為60％以上;陰性對(duì)照組小鼠在放射治療后SUVmax值