腦膠質(zhì)瘤干細胞放射敏感性的離體研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，占全部原發(fā)性惡性腫瘤的1.6％，其中又以Ⅳ級膠質(zhì)瘤-多形性膠質(zhì)母細胞瘤的惡性程度最高。腦膠質(zhì)瘤的治療以外科切除為主，但由于其呈浸潤性生長，肉眼難以分辨其明確邊界，腫瘤常難以徹底切除。盡管近年來在膠質(zhì)瘤的綜合治療上取得了不少的進步，但預后仍然很差，腫瘤在治療原位的復發(fā)仍是一個比較普遍的現(xiàn)象。接受了外科手術(shù)、術(shù)后放療及化療綜合治療手段的患者平均生存期為14.6月。 腦膠質(zhì)瘤的臨床治療缺乏突破性

2、進展的一個重要原因很可能是忽視了該病的細胞起源。為了取得實質(zhì)上的進步，我們需要進一步了解膠質(zhì)瘤對現(xiàn)有治療措施抵抗性的機制以及初次治療后復發(fā)的原因。目前關(guān)于在膠質(zhì)瘤放療后復發(fā)這個普遍的現(xiàn)象中起關(guān)鍵作用的是哪種細胞正逐漸成為一個熱門話題。先前的觀點認為腫瘤細胞術(shù)后殘留是復發(fā)的根源。隨著腫瘤干細胞學說的提出，認為一小部分因惡性轉(zhuǎn)化而獲得了自我更新能力的干細胞或前體細胞，可能是決定腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和對治療敏感與否的關(guān)鍵細胞。最近國內(nèi)

3、外一些學者陸續(xù)從不同級別的膠質(zhì)瘤和體外長期培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞株中分離培養(yǎng)出CD133陽性的腫瘤干細胞，發(fā)現(xiàn)它們在體外培養(yǎng)條件下可以自我更新，具有多向分化潛能，連續(xù)移植均能夠穩(wěn)定地獲得與親本腫瘤表型一致的移植瘤。因而被認為在決定膠質(zhì)瘤的起源、維持膠質(zhì)瘤的惡性表型等方面起著十分重要的作用。以上述研究理論為依據(jù)，本課題提出腦膠質(zhì)瘤干細胞如在其它惡性腫瘤組織中的腫瘤干細胞一樣，在惡性膠質(zhì)瘤組織中大多處于靜止狀態(tài)，具有明顯的輻射抵抗性，X射線、γ射

4、線等電離輻射對其幾乎不起作用。因而，成為膠質(zhì)瘤放療后原位復發(fā)重要原因之一的假說。 為了驗證上述假說并闡明腦膠質(zhì)瘤干細胞在當前膠質(zhì)瘤放射治療中的輻射抵抗性，在本課題的第一部分，采用CD133標記腦膠質(zhì)瘤干細胞，以免疫磁珠法從惡性膠質(zhì)瘤細胞株U251和新鮮人惡性膠質(zhì)瘤標本中分離出CD133陽性細胞并進行體外培養(yǎng)，通過免疫熒光技術(shù)檢測干細胞標志物CD133、Nestin，誘導分化后檢查分化細胞標志物β-TubulinⅢ、GFAP、MB

5、P的表達以及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察和裸鼠移植致瘤實驗對其干細胞特性加以鑒定，得到以下結(jié)果證明我們分離所得到的CD133陽性細胞是腦膠質(zhì)瘤干細胞：(1)CD133陽性的細胞能夠自我更新并連續(xù)形成亞克隆；(2)保持著未分化狀態(tài)，具有多向分化潛能；(3)CD133陽性的細胞裸鼠移植后能夠產(chǎn)生與親本腫瘤表型一致的移植瘤，而CD133陰性細胞不具有上述所有特性。因而，CD133陽性的腦膠質(zhì)瘤干細胞產(chǎn)生明顯的腫瘤致瘤性。 在第二部分的實驗中，使用

6、60Coγ射線照射體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞、自身存在于U251、人惡性膠質(zhì)瘤標本中的腦膠質(zhì)瘤干細胞，以對比研究它們的放射敏感性。采用TUNEL原位末端標記技術(shù)檢測凋亡、AnnexinV-FITC檢測凋亡率，流式細胞儀及裸鼠移植實驗分別檢測輻射前后細胞周期及致瘤性的變化，并得到如下結(jié)果： 1、體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞的細胞周期分布為G0-G1期占51.65±2.75％，G2-M期23.35±1.25％，S期24.15±2.35％。

7、它們生長、代謝旺盛，對電離輻射敏感，不同劑量的60Coγ射線可誘導凋亡。大于2Gy以上的各照射組凋亡率與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。細胞移植實驗發(fā)現(xiàn)：當體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞接受2Gy以上劑量照射以后不再具有致瘤性。 2、U251細胞株和人惡性膠質(zhì)瘤標本細胞株在體外培養(yǎng)條件下生長、代謝旺盛，對60Coγ射線也表現(xiàn)出與體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞相似的輻射敏感性。但明顯的區(qū)別在于：當U251和人惡性膠質(zhì)瘤標本細胞株接受1

8、4Gy以下劑量照射后行裸鼠移植仍具有致瘤性。 3、不同劑量的60Coγ射線照射U251和人惡性膠質(zhì)瘤標本細胞株后，應用免疫磁珠分選其中的CD133陽性和CD133陰性細胞并行AnnexinV-FITC染色顯示：CD133陰性的腦膠質(zhì)瘤細胞對電離輻射敏感，各照射組凋亡率與對照組相比存在顯著性差異(P＜0.05)，裸鼠移植實驗均不具有致瘤性；而CD133陽性的腦膠質(zhì)瘤干細胞則表現(xiàn)為在14Gy以下，各照射組凋亡率與對照組相比無顯著性差

9、異(P＞0.05)，裸鼠移植實驗仍然具有致瘤性。 4、流式細胞儀檢測U251和人惡性膠質(zhì)瘤標本細胞株中的CD133陽性細胞所占比例及細胞周期發(fā)現(xiàn)：自身存在于U251和人惡性膠質(zhì)瘤標本細胞株中的腦膠質(zhì)瘤干細胞所占比例不高，范圍在9.60-12.18％之間，但其大多處于G0-G1期，約占87.4±4.9％，而S期占6.97±2.73％，G2-M期占6.66±3.25％。與同時位于其中的CD133-膠質(zhì)瘤細胞的細胞周期(G0-G1期占

10、57.35±0.35％，G2-M期18.17±7.83％，S期24.55士7.45％)相比，為不活躍的細胞周期，相對處于靜止狀態(tài)。 總之，通過本實驗的研究，結(jié)果表明：體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細胞處于活躍的細胞周期中，生長代謝旺盛。它們對電離輻射敏感，不同劑量的60Coγ射線可誘導凋亡，低劑量的電離輻射可以破壞腦膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性。而自身存在于U251和人惡性膠質(zhì)瘤標本細胞株中的對維持膠質(zhì)瘤惡性表型起關(guān)鍵作用的腦膠質(zhì)瘤干細胞則大多處