SALL4對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能和化療敏感性的作用研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤，對(duì)于呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的高級(jí)別膠質(zhì)瘤，手術(shù)基本無(wú)法達(dá)完全切除腫瘤的目的，膠質(zhì)瘤術(shù)后容易復(fù)發(fā)?；熕幬锏氖褂脤?duì)延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者的生存期有一定的作用，但高級(jí)別膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，容易發(fā)生對(duì)化療藥物多藥耐藥現(xiàn)象（MDR，multidrug resistance），繼而影響患者的治療效果。
　　SALL4是人SALL基因家族的一員，在維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多向分化能力方面起重要作用，在腫瘤中

2、，SALL4對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、及部分非生殖細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，而在膠質(zhì)瘤中的作用尚不明確。在本課題中，我們將使用免疫組化染色及RT-PCR的方法，在54例腦膠質(zhì)瘤及7例正常腦組織中檢測(cè)SALL4蛋白及mRNA的表達(dá)水平，并通過門診和電話對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行隨訪，明確SALL4蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過構(gòu)建慢病毒，在U251細(xì)胞株中干擾SALL4表達(dá)，檢測(cè)這種情況下膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

3、、凋亡、細(xì)胞周期及侵襲能力方面的改變，從而明確SALL4的異常表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能的影響。然后，將細(xì)胞株同不同濃度替莫唑胺共培養(yǎng)，觀察在細(xì)胞株中敲減SALL4后膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化情況。繼而在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株中敲減SALL4后，使用RT-PCR及Western blot法在mRNA及蛋白水平上檢測(cè)胚胎干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG及化療耐藥基因ABCG2、MGMT的表達(dá)水平變化。從而對(duì)明確SALL4表達(dá)

4、與膠質(zhì)瘤細(xì)胞干細(xì)胞樣特性及化療耐藥基因之間的關(guān)系。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 SALL4在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義
　　目的：本部分研究目的即檢測(cè)SALL4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，并明確其表達(dá)在診斷和判斷預(yù)后方面的作用。
　　方法：在54例膠質(zhì)瘤組織及7例正常腦組織中使用免疫組化染色及實(shí)時(shí)定量PCR的方法，在正常腦組織和膠質(zhì)瘤中檢測(cè)SALL4蛋白及mRNA的表達(dá)，對(duì)相關(guān)臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

5、，并對(duì)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行生存分析。
　　結(jié)果：免疫組化染色發(fā)現(xiàn)SALL4蛋白表達(dá)大多定位于細(xì)胞質(zhì)中，著色后呈棕黃色/棕褐色顆粒，正常腦組織中僅有少量SALL4蛋白表達(dá)。在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中，SALL4陽(yáng)性表達(dá)明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤（P=0.030），RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SALL4 mRNA在正常腦組織相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.52，低級(jí)別膠質(zhì)瘤中為1.93±0.81，而在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中為2.42±0.58，各組間有顯著性差異（P<0.05）

6、。而免疫組化及RT-PCR檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)SALL4表達(dá)與患者年齡，性別，術(shù)前KPS評(píng)分及腫瘤切除程度無(wú)明顯相關(guān)。ROC分析提示通過檢測(cè)SALL4 mRNA來(lái)區(qū)分膠質(zhì)瘤與正常腦組織的敏感性為92.59％，特異性為85.71%。Cox生存分析提示SALL4表達(dá)與患者預(yù)后明顯相關(guān)，SALL4表達(dá)水平較高患者預(yù)后較差。
　　結(jié)論：SALL4在膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展中起重要作用，檢測(cè)SALL4的表達(dá)有助于膠質(zhì)瘤的診斷，亦有助于判斷患者的預(yù)后。

7、>　　第二部分 慢病毒敲減SALL4后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞功能及化療敏感性的影響
　　目的：明確SALL4表達(dá)水平變化對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲能力及化療敏感性的影響。
　　方法：構(gòu)建慢病毒，在U251細(xì)胞株中選擇對(duì)SALL4干擾效果較好的一組，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，AV/PI染色測(cè)定細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期改變，Transwell試驗(yàn)檢測(cè)侵襲性改變。繼而將細(xì)胞株同不同濃度替莫唑胺共培養(yǎng)，觀察在細(xì)

8、胞株中敲減SALL4后膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化情況。
　　結(jié)果：根據(jù)PCR和Western blot檢驗(yàn)結(jié)果選擇72h Lentivirus-homo-SALL4-4組慢病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞72小時(shí)后，測(cè)空白對(duì)照組OD值為1.98±2.30；Lenti-GFP組為2.10±0.21；檢測(cè)OD值在Lenti-shRNA組為1.52±0.11。Lenti-shRNA組細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P<0.05）。細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)

9、果顯示，空白對(duì)照組早期凋亡細(xì)胞6.10±0.14%，Lenti-GFP組為29.95±0.86%，而Lenti-shRNA組為86.41±0.87%。和空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，敲減SALL4后，膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞早期凋亡顯著增加（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組中細(xì)胞處于G0-G1期百分比為42.30±0.42%，處于S期百分比為36.69±0.36%，處于G2–M期百分比為21.02±0.25%；Lenti-GFP組中G0-G1期百分比

10、為52.11±1.92%，S期百分比為26.21±0.39%，G2-M期百分比為21.68±2.08%；Lenti-shRNA組G0-G1期百分比為78.93±2.49%，S期百分比為11.57±0.60%，G2-M期百分比為9.50±1.93%。Lenti-shRNA組中處于G0-G1期的細(xì)胞數(shù)量數(shù)量明顯高于其他兩組，而處于S期和G2–M期的細(xì)胞數(shù)量較其他兩組則顯著降低（P<0.05）。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組中侵襲細(xì)胞均數(shù)為：94

11、.33±3.51；Lenti-GFP組中為：91.33±1.53；Lenti-shRNA組為：47.33±3.21。Lenti-shRNA組中侵襲細(xì)胞均數(shù)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組有顯著地下降（P<0.01），細(xì)胞侵襲能力明顯受到抑制。替莫唑胺IC50試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組IC50值為113.67±23.07μg/ml，Lenti-GFP組為114.93±20.91μg/ml，Lenti-shRNA組為75.86±7.28μg/ml，敲減SA

12、LL4后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性明顯增強(qiáng)（P<0.05）。
　　結(jié)論：SALL4的表達(dá)水平對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞功能有重要影響，敲減SALL4可以提高膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物替莫唑胺的敏感性。
　　第三部分 敲減SALL4后膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞功能及化療敏感性變化的機(jī)制探討
　　目的：明確SALL4表達(dá)與胚胎干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG及化療耐藥基因ABCG2、MGMT之間的關(guān)系。
　　方法：在

13、膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株中敲減SALL4后，使用RT-PCR及Western blot法檢測(cè)OCT4、SOX2、NANOG、ABCG2及MGMT的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：敲減SALL4后，RT-PCR檢測(cè)U251細(xì)胞株中OCT4、SOX2、NANOG、ABCG2及MGMT的mRNA表達(dá)水平均顯著下降（P<0.05），Western blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平改變與RT-PCR一致。
　　結(jié)論：SALL4的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的干細(xì)胞樣