SALL4抑制PTEN表達通過PI3K-AKT通路促進膠質(zhì)瘤細胞增殖的研究.pdf

1、目的：近年來，隨著醫(yī)療事業(yè)飛速發(fā)展，膠質(zhì)瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷已得到了有效保障；術(shù)中運用顯微外科技術(shù)及神經(jīng)導(dǎo)航儀，一定條件下大大提高了膠質(zhì)瘤的手術(shù)切除率；此外，術(shù)后個體化的放化療、免疫治療等綜合治療手段也已到達廣泛使用。然而，即使膠質(zhì)瘤診療水平不斷的提高，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的改善、生存質(zhì)量的提高極為有限，作為目前顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤的平均生存期僅為15-18個月。
　　導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，并且迅速生長的原因有很多，包括基因突變，藥物致癌，物理致

2、癌，化學(xué)致癌，遺傳等因素。在這其中癌基因的激活和抑癌基因的失活已得到研究界普遍認可。近期研究發(fā)現(xiàn)人類婆羅雙樹樣基因4（SALL4）具有調(diào)控腫瘤的功能，并成為評估腫瘤預(yù)后的一個新標記物。SALL4與參與果蠅多種器官發(fā)育的果蠅婆羅雙樹基因Spalt為同源基因，是近期新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，編碼一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，位于人類20號染色體q13，分為SALL4A和SALL4B兩亞型。研究表明干性基因SALL4具有維持胚胎干細胞的多能性和自我更新的功能

3、，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括白血病，肝癌，胃癌，食管癌，肺癌等常見惡性腫瘤。敲除SALL4基因能夠抑制某些腫瘤細胞的增殖，增加其凋亡，降低其侵襲能力，在肝細胞肝癌中高表達SALL4基因往往意味著更短的生存期和較差的預(yù)后。而抑癌基因PTEN的缺失或者突變亦參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在某些腫瘤中SALL4可以靶向抑制PTEN的表達，發(fā)揮促癌作用。SALL4與膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚不清楚。因此，我們首先檢測SALL4在膠質(zhì)瘤中的表達，再運

4、用siRNA,下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞株中SALL4表達，PTEN阻滯劑phen(bpv)處理低表達SALL4的細胞，研究SALL4對膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能的影響及其作用機制。
　　方法：我們收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科近3年來，手術(shù)切除的不同級別的膠質(zhì)瘤標本69例，標本液氮中冷凍保存并提取其總得RNA，運用實時定量PCR技術(shù)，檢測腫瘤標本中SALL4的表達水平以及不同級別中SALL4表達有無差異。體外實驗，我們分析不同級別膠質(zhì)瘤細胞株中SA

5、LL4表達水平，并選擇合適的膠質(zhì)瘤細胞株作為實驗對象。運用將siRNA-SALL4轉(zhuǎn)染技術(shù)，下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞株U87和U251中SALL4基因的表達，與此同時使用PTEN抑制劑，進而對腫瘤細胞增殖能力進行檢測，予以細胞周期分析等。Wstern Blot分析 PTEN/PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白,如PTEN,PI3K,P-PI3K,AKT,P-AKT,cyclin D1的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.SALL4在人腦膠質(zhì)

6、瘤及膠質(zhì)瘤細胞株中表達。運用實時定量PCR技術(shù)，對6例非瘤腦組織及69例不同級別的人腦膠質(zhì)瘤標本中SALL4表達進行分析。其結(jié)果提示：在膠質(zhì)瘤標本中SALL4水平比非瘤腦組織高（P<0.05），且隨著腫瘤級別增高SALL4表達水平亦明顯增高。不同種級別膠質(zhì)瘤細胞株中SALL4表達不同，與腫瘤標本類似，級別越高的膠質(zhì)瘤細胞株SALL4表達水平越高（P<0.05）。
　　2.敲除SALL4基因，抑癌基因PTEN的表達明顯提高。SALL

7、4-siRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細胞后，下調(diào)了SALL4的表達，分別從蛋白水平及mRNA水平檢測抑癌基因PTEN的表達，結(jié)果提示：下調(diào)SALL4，PTEN蛋白及mRNA明顯增加（P<0.05）。
　　3.下調(diào)SALL4的表達，U87及U251細胞增殖明顯受抑制。膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)染SALL4-siRNA后，增殖能力下降，進一步行細胞周期分析，結(jié)果提示細胞阻滯在G1，即處于靜止G1期細胞比例增加，而處于分裂S期細胞所占比例降低，而PTEN抑制劑能夠

8、很大程度上逆轉(zhuǎn)這種抑制效應(yīng)。
　　4. Western Blot技術(shù)分析敲除SALL4后，PTEN,PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白改變。敲除SALL4后，PTEN表達上調(diào)，PI3K/AKT磷酸化水平下降，p-PI3K,p-AKT表達
　　水平受抑制，細胞周期素cyclinD1表達下降。預(yù)先用SALL4-siRNA處理膠質(zhì)瘤細胞株，再用PTEN抑制劑處理細胞，PI3K/AKT磷酸化水平的抑制效應(yīng)明顯改變。
　　結(jié)論:SAL