NOX4通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖.pdf

1、目的：
　　1、研究NOX4對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的作用；
　　2、探索NOX4調(diào)控NSCLC細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、免疫組織化學(xué)法
　　采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)152例NSCLC病人癌組織及癌旁組織中NOX4及p-Akt蛋白陽(yáng)性率表達(dá)情況，并分析NOX4與臨床分期的相關(guān)性。
　　2、MTT法
　　用 pCMV-NOX4、pRS-shNOX4、pcDNA3.1-Akt載體構(gòu)建 N

2、OX4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)、NOX4穩(wěn)定缺失、Akt過(guò)表達(dá)的A549和H460細(xì)胞，并將其接種于96孔板后檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。
　　3、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)
　　NOX4過(guò)表達(dá)、NOX4缺失、Akt過(guò)表達(dá)的A549和H460細(xì)胞種板后培養(yǎng)14天，檢測(cè)并比較NSCLC細(xì)胞的集落形成能力。
　　4、成瘤實(shí)驗(yàn)
　　將NOX4過(guò)表達(dá)、NOX4缺失的A549和H460細(xì)胞懸液無(wú)菌皮下注射注入裸鼠體內(nèi)，每隔一天觀察并測(cè)量瘤體大小，記錄瘤體

3、的變化。
　　5、蛋白免疫印跡
　　驗(yàn)證NSCLC細(xì)胞系中NOX4蛋白表達(dá)水平的高低，并檢測(cè)NOX4過(guò)表達(dá)的NSCLC穩(wěn)轉(zhuǎn)株中p-Akt、Akt的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、對(duì)NSCLC病人臨床標(biāo)本分析得出，NOX4上調(diào)與NSCLC的臨床分期及預(yù)后（P＜0.001）密切相關(guān)，且NOX4在人NSCLC癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，

4、與對(duì)照組相比，NOX4過(guò)表達(dá)促進(jìn) NSCLC細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)，NOX4缺失抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)。
　　3、阻斷PI3K/Akt通路能有效逆轉(zhuǎn)NOX4過(guò)表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖的作用。當(dāng)使用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002或Wartmannin時(shí)，NOX4促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖的作用被逆轉(zhuǎn)；與對(duì)照組相比，NOX4過(guò)表達(dá)能使A549和H460細(xì)胞中磷酸化Akt活性增強(qiáng)，NOX4缺失能使A549和H46

5、0細(xì)胞中磷酸化Akt活性降低（P＜0.05）；經(jīng)過(guò)分析152例NSCLC病人臨床標(biāo)本得出，在肺腺癌和肺鱗癌中，NOX4高表達(dá)與 p-Akt的表達(dá)密切相關(guān)（P＜0.05）；對(duì) NOX4過(guò)表達(dá)的A549和 H460細(xì)胞荷瘤鼠給予 LY294002，結(jié)果表明經(jīng)給藥后所形成的腫瘤比NOX4過(guò)表達(dá)組明顯減小。
　　4、在NSCLC細(xì)胞系中Akt和NOX4能相互激活并促進(jìn)細(xì)胞增殖。在A549和H460細(xì)胞中，抑制 Akt后，NOX4的表達(dá)量下

6、調(diào)；A549和 H460細(xì)胞轉(zhuǎn)染Akt過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，NOX4的表達(dá)上調(diào)；當(dāng)NOX4與Akt均過(guò)表達(dá)時(shí)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖作用比對(duì)照組強(qiáng)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、在NSCLC病人病理標(biāo)本中NOX4表達(dá)量顯著增高；
　　2、NOX4過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖；
　　3、PI3K/Akt通路激活參與NOX4調(diào)控NSCLC細(xì)胞的增殖作用；
　　2、NOX4和PI3K/Akt通路相互激活并促進(jìn)N