SDF-1-CXCR4通過(guò)PI3K-Akt途徑誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向受損脊髓組織遷徙.pdf

1、研究目的:
　　SDF-1/CXCR4通過(guò)PI3K/Akt途徑在BMSCs向損傷脊髓組織遷徙的誘導(dǎo)作用及影響因素。
　　研究方法:
　　1.用Percoll密度離心法從大鼠骨髓內(nèi)分離出間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行傳代，以免疫組化的方法（SABC法）進(jìn)行鑒定。
　　2.用Allen打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。
　　3.用Real-time PCR檢測(cè)BMSCs中編碼CXCR4和PI3K基因的存在。
　　4.用

2、Western Bolt檢測(cè)BMSCs表面CXCR4和PI3K的蛋白表達(dá)。
　　5.用Transwell小室遷徙實(shí)驗(yàn)為主要的體外實(shí)驗(yàn)方法，研究SDF-1/CXCR4對(duì)BMSCs
　　的體外遷徙誘導(dǎo)作用并精確測(cè)定SDF-1的最佳誘導(dǎo)濃度。實(shí)驗(yàn)分為：陰性對(duì)照組（上室加入BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入不含SDF-1的血清培養(yǎng)基）；實(shí)驗(yàn)組（上室加入BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入含不同濃度SDF-1的血清培養(yǎng)基）；CXCR4阻斷組（上室加

3、入CXCR4抑制劑AMD3100預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入不同濃度的SDF-1的血清培養(yǎng)基）；試劑對(duì)照組（上室加入CXCR4抑制劑AMD3100預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入不含SDF-1的血清培養(yǎng)基）。用不同干預(yù)措施后急性脊髓損傷模型大鼠的脊髓功能恢復(fù)情況（后肢運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分）研究SDF-1/CXCR4對(duì)BMSCs向脊髓損傷組織遷徙的影響。實(shí)驗(yàn)分為：空白對(duì)照組（模型大鼠不給予任何處理）；陰性對(duì)照組（模型大鼠尾靜脈注

4、射生理鹽水）；試劑對(duì)照組（模型大鼠尾靜脈注射AMD3100）；BMSCs移植組（模型大鼠尾靜脈注射BMSCs細(xì)胞懸液）、CXCR4抑制組（模型大鼠尾靜脈注射CXCR4抑制劑預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液）。
　　6.用Transwell小室遷徙實(shí)驗(yàn)為主要的體外實(shí)驗(yàn)方法，研究PI3K/Akt途徑在SDF-1/CXCR4趨化BMSCs過(guò)程中的影響。實(shí)驗(yàn)分為：陰性對(duì)照組（上室加入BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入不含SDF-1的血清培養(yǎng)基），試

5、劑AMD3100對(duì)照組（上室加入CXCR4抑制劑AMD3100預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入不含SDF-1的血清培養(yǎng)基），CXCR4抑制組（上室加入CXCR4抑制劑AMD3100預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入含SDF-1的血清培養(yǎng)基），試劑LY294002對(duì)照組（上室加入PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入不含SDF-1的血清培養(yǎng)基）），PI3K抑制組（上室加入PI3K抑制劑LY29400

6、2預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液，下室加入含SDF-1的血清培養(yǎng)基），外源性處理組（上室加入CXCR4抑制劑AMD3100預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液和外源性PI3K產(chǎn)物PIP3，下室加入含SDF-1的血清培養(yǎng)基）。用不同干預(yù)措施后急性脊髓損傷模型大鼠的脊髓功能恢復(fù)情況（后肢運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分）研究SDF-1/CXCR4對(duì)BMSCs向脊髓損傷組織遷徙的影響。實(shí)驗(yàn)分為：空白對(duì)照組（模型大鼠不給予任何處理）；陰性對(duì)照組（模型大鼠尾靜脈注射生理鹽水

7、）；試劑AMD3100對(duì)照組（模型大鼠尾靜脈注射AMD3100）；試劑LY294002對(duì)照組（模型大鼠尾靜脈注射LY294002）；BMSCs移植組（模型大鼠尾靜脈注射BMSCs細(xì)胞懸液）；CXCR4抑制組（模型大鼠尾靜脈注射CXCR4抑制劑AMD3100預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液）；PI3K抑制組（模型大鼠尾靜脈注射PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液）；外源性處理組（模型大鼠尾靜脈注射CXCR4抑制劑AMD3

8、100預(yù)處理過(guò)的BMSCs細(xì)胞懸液和外源性PI3K產(chǎn)物PIP3）。
　　7.本研究中，均值以x±s表示。用方差分析（Analysis of variance，ANOV）分析多組間的差異，組間的兩兩比較用q檢驗(yàn)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)分析軟件包（Statistic Package for Social Science，SPSS）17.0處理，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1. BMSCs的細(xì)

9、胞形態(tài)及免疫組化鑒定：典型的BMSCs呈長(zhǎng)梭形或多角形的成纖維細(xì)胞樣，有長(zhǎng)短、粗細(xì)不一的胞漿突起。細(xì)胞早期呈集落樣生長(zhǎng)，集落呈放射狀或漩渦狀，后期細(xì)胞逐漸密集，集落不可分辨。免疫組化顯示CD34—、CD44+、CD54+、CD99+。
　　2. Allen打擊法建立大鼠急性損傷模型：用70g·cm的能量對(duì)大鼠T10-11水平脊髓進(jìn)
　　行垂直打擊，打擊瞬間可見(jiàn)大鼠四肢及軀體抽搐，尾部呈痙攣樣擺動(dòng)，表示打擊成功。3-5min后

10、可見(jiàn)受損傷脊髓呈暗紅色，有出血、水腫表現(xiàn)。建模后飼養(yǎng)一周，后肢運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分從術(shù)前的18.73±0.85降至術(shù)后的3.04±0.65，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3. BMSCs中CXCR4和PI3K的基因存在和蛋白表達(dá)：BMSCs存在CXCR4基因和PI3K基因，Real-time PCR的擴(kuò)增△CT值分別為16.47和13.43.CXCR4和PI3K在BMSCs中均有蛋白表達(dá)。
　　4. SDF-1/CXC

11、R4對(duì)BMSCs遷徙的誘導(dǎo)作用：在體外實(shí)驗(yàn)中，試劑對(duì)照組和陰性對(duì)照組遷徙到下室的細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），試劑AMD3100本身對(duì)BMSCs的遷徙沒(méi)有影響。在此基礎(chǔ)上，相比陰性對(duì)照組，下室中加入SDF-1無(wú)血清培養(yǎng)基的小室，遷徙到下室的細(xì)胞數(shù)都有增加（P＜0.05），且隨著下室中SDF-1濃度的增加而增加。SDF-1濃度為144.5±4.4ng/ml時(shí)達(dá)到最佳遷徙效果，繼續(xù)增加SDF-1濃度，遷徙到下室的細(xì)胞數(shù)也不會(huì)隨之增加。

12、AMD3100阻斷CXCR4后，SDF-1對(duì)BMSCs不再有誘導(dǎo)遷徙作用（P＞0.05）。
　　5. PI3K/Akt途徑對(duì)SDF-1/CXCR4誘導(dǎo)BMSCs遷徙的影響：在體外實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證試劑AMD3100和LY294002對(duì)BMSCs的自然遷徙沒(méi)有影響的基礎(chǔ)上（P＞0.05），CXCR4抑制組和PI3K抑制組遷徙到下室的細(xì)胞數(shù)均小于正常的SDF-1趨化組（P＜0.05），而在CXCR4抑制組中外源性的加入PI3K產(chǎn)物PIP3，

13、則又可以觀察到SDF-1的趨化作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證了試劑AMD3100、LY294002以及注射操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響（P＞0.05），向模型大鼠尾靜脈注射PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理過(guò)的BMSCs懸液與注射CXCR4抑制劑AMD3100預(yù)處理過(guò)的BMSCs懸液，模型大鼠的脊髓功能恢復(fù)程度均相同，均介于移植BMSCs組和陰性對(duì)照組之間（P＜0.05）。在CXCR4抑制組中外源性的加入PI3K產(chǎn)物PIP3，模型大鼠的脊髓功能恢

14、復(fù)與不抑制CXCR4時(shí)的效果相同（P＞0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　1. Percoll密度離心法可以從大鼠長(zhǎng)骨骨髓中分離出純度較高的BMSCs。
　　2. Allen打擊法能夠建立符合要求的大鼠急性損傷模型。
　　3. SDF-1/CXCR4可以誘導(dǎo)BMSCs向受損的脊髓組織遷徙。
　　4. SDF-1濃度為144.5na/ml時(shí)SDF-1/CXCR4對(duì)BMSCs的遷徙誘導(dǎo)效果達(dá)到最佳。
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