SDF-1-CXCR4軸以及MCP-1-CCR2軸對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞遷移及歸巢的影響.pdf

1、研究背景和目的
　　缺血性心臟病系威脅人類健康的主要疾病之一，其發(fā)病率仍在不斷上升，仍然是目前臨床上充血性心衰病人的主要病因之一。傳統(tǒng)認為心肌細胞屬于終末期分化細胞，一旦損傷壞死則不能再生。盡管新近有實驗提出成人心肌細胞本身可能具有分裂增殖的能力，但其分裂指數(shù)僅為0.03％～0.9％[1-3];也有實驗[4，5]提出心肌中存在的心肌干/祖細胞（cardiacsterm/progenitorcells，CSCs/CPCs）可以分化為

2、成熟心肌細胞，但由于其數(shù)量極為有限，不能在心肌梗死后產(chǎn)生足夠的新生心肌取代梗死之心肌，最終心肌梗死病人的梗死心肌纖維化，并絕大部分由疤痕組織替代，喪失心臟作為血泵的收縮功能，纖維化的心肌對剩余的健康心肌也產(chǎn)生嚴重影響，隨之而來的心室重構(gòu)進一步影響心臟功能，最終發(fā)展為終末期心臟病和充血性心衰。雖然心臟移植是目前治療終末期心臟病病人最為有效的方法，但由于供體心臟來源嚴重短缺，加上各種免疫抑制劑的副作用給人體帶來的不良影響，嚴重限制了心臟移植

3、的廣泛開展和應用。心臟輔助裝置的應用可以使部分病人得到短時的改善，但常常只能作為等待心臟移植的過渡手段，而不能達到長期的治療效果，加上其昂貴的醫(yī)療費用，難以在臨床大規(guī)模使用和開展。
　　目前對缺血性心臟病常用的治療方法包括藥物治療、冠狀動脈介入治療和心臟冠狀動脈搭橋等方法，均主要集中于改善心肌缺血，而對壞死心肌沒有任何作用。因此，國際上一直在探索新的治療方法。已有實驗提示，干細胞可能分化為心肌細胞、促進梗死區(qū)血管新生，改善心臟功能

4、。胚胎干細胞由于排斥反應及倫理問題，其研究、應用受到一定限制;而自體骨髓干細胞取材簡單、易于增殖、移植后無免疫排斥反應，又不涉及倫理問題，正在成為國內(nèi)外研究的熱點。研究顯示:骨髓干細胞具有復雜性、多能性和遷移性。成年骨髓細胞包括不同的成熟階段，也包括原始階段的骨髓干細胞或稱之為多系祖細胞，以及骨髓基質(zhì)和開始分化的各系定向祖細胞。骨髓干細胞沒有一種具體的分化傾向，是一種具有多分化潛能及自我修復功能的早期未分化細胞，幾乎可能轉(zhuǎn)化成人體任何組

5、織。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是其中最具分化潛能的一組細胞，但MSCs也并非是完全純化的細胞群體，而是由不同發(fā)育分化潛能的干細胞組成。近來已發(fā)現(xiàn)較多MSCs表面標記，而且不同成熟程度的MSCs表面標記并不完全相同，由此可見其復雜性。
　　骨髓干細胞治療缺血性心臟病主要涉及到心肌缺血后局部細胞因子的表達變化、細胞因子對移植或自身干細胞的趨化歸巢作用以及干細胞歸巢后的治療作用。可供治療選用的

6、干細胞有多種亞型，包括造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞、間質(zhì)干細胞、單個核細胞等，各種細胞亞型有其自身不同的特點。造血干細胞較其它細胞數(shù)量多，研究最為深入、透徹，但由于其分化范圍狹窄，只能分化為造血系細胞，從而使其應用受到一定限制;內(nèi)皮祖細胞可以分化為血管內(nèi)皮細胞，促進血管新生，從而改善組織血液供應;間質(zhì)干細胞具有多種分化潛能，可以分化為治療所需要的各種目標細胞而發(fā)揮治療作用，是很理想的移植細胞;而骨髓單個核細胞由于獲取方便、不需培養(yǎng)、細胞種類豐

7、富而獲得部分研究者的青睞。但無論選用哪一種細胞都涉及到一個中心的問題:歸巢。干細胞必須歸巢到目標區(qū)域才能產(chǎn)生治療作用。歸巢一詞起源于骨髓移植療法的開展，其意義為經(jīng)靜脈輸入的干細胞通過血液循環(huán)特定地植入到支持其生長發(fā)育的骨髓微環(huán)境中的過程。隨著研究范圍的擴展，目前歸巢的意義已擴展為骨髓干細胞在特定條件的誘導下移行并定位于機體目標組織的過程。
　　心肌梗死后梗死區(qū)域局部產(chǎn)生劇烈的炎癥反應，生成多種細胞因子，包括SDF-1與MCP-1;

8、Ma等[6]研究提示SDF-1于心肌梗死后早期升高，并能通過SDF-1/CXCR4軸促進移植的MSCs歸巢到梗死心肌組織中;而Askari等[7]在重建梗死心肌中SDF-1的表達后，觀察到G-CSF動員的骨髓干細胞歸巢到了梗死心肌中。Lu等[8]研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠心肌梗死3d后梗死心肌中MCP-1含量顯著升高，于第7d達峰值;而Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，44.6％的MSCs表達MCP-1的受體CCR2，并且可通過MCP-1與CCR2的結(jié)合促進

9、MSCs歸巢。這些研究均提示SDF-1、MCP-1在促進干細胞歸巢中起到了一定的作用。歸巢后的干細胞可能分化為心肌樣細胞或分泌細胞因子促進血管新生、減少心肌細胞凋亡，從而改善心臟功能。內(nèi)源性SDF-1及MCP-1可能數(shù)量有限，且表達時間過短，與心肌梗死后早期劇烈的炎癥反應重疊，限制了其促使干細胞歸巢并改善心臟功能的治療作用;而有關(guān)外源性SDF-1及MCP-1促進干細胞歸巢的研究很少。因此，有必要對外源性SDF-1及MCP-1在干細胞歸巢

10、中的作用進行研究。而且，多數(shù)研究的結(jié)果提示移植的干細胞未能歸巢到最需要修復的梗死中心區(qū)域，而是植入到了梗死周邊區(qū)域。這種現(xiàn)象是否與梗死后心肌不同部位歸巢相關(guān)因子的表達存在差異有關(guān)尚不明確。MI后隨著時間的推移，梗死心肌的修復重構(gòu)也在不斷進行，心肌重構(gòu)導致梗死區(qū)變薄、膨出及心臟整體擴張，對心功能產(chǎn)生極為不利的影響。由于我國經(jīng)濟基礎差，人民健康意識淡薄等原因，許多心肌梗死患者，尤其是廣大農(nóng)村的患者，對缺血性心臟病的認識不足，從而延誤了疾病的

11、治療，使病情不斷進展而發(fā)展為終末期心臟病，導致充血性心衰的發(fā)生。干細胞移植給廣大患者帶來了福音，而MI后應該何時給予干細胞移植及采用外源性細胞因子干預時究竟應該給多少劑量等均有待于進一步研究。
　　基質(zhì)細胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor，SDF-1α)屬于CXC族趨化因子成員，是生物體內(nèi)一種關(guān)鍵的細胞趨化因子。CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)是SDF-1α的受

12、體，表達于多種干/祖細胞表面，可與SDF-1α耦合介導其遷移。很多研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血、血管內(nèi)膜損傷可上調(diào)SDF-1α的表達，介導多種干細胞歸巢新生血管、修復損傷內(nèi)皮。SDF-1α參與心梗后骨髓間充質(zhì)干細胞分化調(diào)控，可促進血管新生、減小心梗面積。但SDF-1α/CXCR4軸調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞歸巢的作用及機制有待進一步研究。
　　磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)蛋白家族是一種胞內(nèi)

13、磷脂酰肌醇激酶，廣泛表達于多種組織與細胞中，參與細胞遷移、增殖、分化、凋亡、血管生成和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。多項實驗表明，PI3K參與SDF-1α/CXCR4調(diào)控的骨髓基質(zhì)干細胞、內(nèi)皮祖細胞、造血干細胞等多種干/祖細胞趨化作用及遷移。但PI3K/Akt的抑制劑wortmannin和ser磷酸化抑制劑LY294002可阻斷這一效應，這一結(jié)果表明，PI3K通路在骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移、歸巢中發(fā)揮作用。通過實驗證實，磁珠分選后的間充

14、質(zhì)干細胞表面表達有CXCR4/CCR2，它們與趨化因子的相互作用可通過激活PI3K途徑促進其他干/祖細胞遷移、歸巢。本課題觀察CXCR4/CCR2表達對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外遷移和體內(nèi)歸巢的影響，同時探討PI3K通路是否參與CXCR4/CCR2介導的骨髓間充質(zhì)干細胞遷移;采用磁珠分選CXCR4/CCR2陽性細胞聯(lián)合梗死周邊注射小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，評價SDF-1/CXCR4軸和MCP-1/CCR2在骨髓間充質(zhì)干細胞歸巢及心肌再生

15、中的作用，并探討PI3K通路在其中的作用。
　　本研究成功培養(yǎng)了ICR小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞，建立ICR小鼠心肌梗死模型，分選骨髓間充質(zhì)干細胞中CXCR4和CCR2表達陽性的細胞，研究其歸巢和遷移能力的差異，對小鼠梗死心肌修復的影響，并對PI3K/Akt通路在該歸巢效應中的潛在作用進行了初步探討。
　　方法:
　　1.無菌條件下取5-8周齡ICR小鼠的脛腓骨，體外全骨髓貼壁法培養(yǎng)，80％鋪滿后進行傳代，流式鑒定細胞表面

16、分子表達以及細胞周期，G0/G1期細胞量較多，CD44、CD90、CD105陽性率較高的細胞符合骨髓間充質(zhì)干細胞特征。
　　2.氣管插管輔助3、4肋間開胸結(jié)扎冠狀動脈下支的方法建立小鼠心梗模型，檢測LVEF、FS、LVEDD等指標，鑒定小鼠模型是否構(gòu)建成功。
　　3.小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)擴增聯(lián)合免疫磁珠分選(MACS)純化CXCR4/CCR2陽性骨髓間充質(zhì)干細胞，并作克隆培養(yǎng)，流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞分選前后的

17、細胞表面標志物的表達情況。
　　4.采用Transwell模型檢測CXCR4/CCR2對骨髓間充質(zhì)干細胞遷移的影響及其可能機制。下室種植心肌細胞，上室為純化的骨髓間充質(zhì)干細胞。實驗共分為四組，對照組，CXCR4+/CCR2+組，CXCR4+/CCR2-組，CXCR4-/CCR2+組，24h后5個高倍視野計數(shù)遷移的細胞。免疫熒光檢測下室穿過細胞。
　　5.左冠脈前降支(LAD)結(jié)扎建立小鼠心梗模型后，在梗死區(qū)周邊選取5個位點注

18、射分選后的細胞，觀察移植骨髓間充質(zhì)干細胞對體內(nèi)歸巢及對心梗修復的影響。實驗共分為7組:假手術(shù)組（sham組）:開胸，不作冠脈前降支（LAD）結(jié)扎也不作干細胞移植;心梗組（MI組）:結(jié)扎LAD制造心梗，但不作其它處理;PBS對照組（empty組）:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射PBS;CXCR4+/CCR2+組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4+/CCR2+骨髓間充質(zhì)干細胞，共選5個位點注射，每次注射30ul，細胞濃度2×106個/ml;

19、CXCR4+/CCR2-組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4+/CCR2-骨髓間充質(zhì)干細胞，共選5個位點注射，細胞數(shù)量同上;CXCR4-/CCR2+組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4-/CCR2+骨髓間充質(zhì)干細胞，共選5個位點注射;CXCR4-/CCR2-組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4+/CCR2+骨髓間充質(zhì)干細胞，共選5個位點注射，3周后檢測梗死周邊進行干細胞注射的對照組和細胞組CM-dil標記的間充質(zhì)干細胞向梗死

20、區(qū)遷移的情況(n=5)。
　　6.歸巢到梗死區(qū)的骨髓間充質(zhì)干細胞分化情況采用免疫熒光檢測。檢測從周邊遷移到梗死區(qū)的CM-dil標記的骨髓間充質(zhì)干細胞的數(shù)量，每個心臟標本，梗死區(qū)隨機取10個高倍視野，計算CM-DIL陽性細胞的比例。
　　7.檢測PI3K/Akt通路在CXCR4/CCR2細胞遷移過程中的影響。在transwell小室模型中，下室加入MCP-1/SDF-1，LY組細胞均用LY294002孵育。本實驗分12組:co

21、ntrol組、CXCR4+/CCR2+組、CXCR4+/CCR2-組、CXCR4-/CCR2+組、control(MCP-1/SDF-1)組、CXCR4+/CCR2+(MCP-1/SDF-1)組、CXCR4+/CCR2-(MCP-1/SDF-1)組、CXCR4-/CCR2+(MCP-1/SDF-1)組control(MCP-1/SDF-1、LY)組、CXCR4+/CCR2+(MCP-1/SDF-1、LY)組、CXCR4+/CCR2-(M

22、CP-1/SDF-1、LY)組、CXCR4-/CCR2+（MCP-1/SDF-1、LY）組。WesternBlot檢測pAkt表達水平，各組WB條帶的OD值與內(nèi)參組的OD值的比值作為各組的pAkt表達強度，比較PI3K/Akt通路在CXCR4/CCR2細胞遷移中所起的作用。
　　結(jié)果:
　　1.全骨髓貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞成功，CD44/CD90/CD105均高表達，G0/G1期細胞率高于70％。
　　2.ICR小

23、鼠心梗模型構(gòu)建成功，與對照組比較，心梗4周后小鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)明顯增加(P＜0.05)，左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短指數(shù)(FS)明顯降低(P＜0.05)。二維圖像見心梗模型組左室腔擴大，左室前壁出現(xiàn)節(jié)段性運動減弱、消失及反向運動等現(xiàn)象;梗死區(qū)局部有心肌強回聲，室壁變薄。
　　3.MACS分選獲得純度較高的CXCR4/CCR2陽性骨髓間充質(zhì)干細胞，在體外可克隆擴增。流式結(jié)果表

24、明，MACS分選前，混合細胞中CXCR4陽性細胞比例為31.09±0.35％，經(jīng)c-kit免疫磁珠純化后為86±4.51％，CCR2陽性細胞比例為16.52±0.76％，經(jīng)c-kit免疫磁珠純化后為56±6.37％，CXCR4/CCR2雙陽性細胞比例分別為45.62±5.16％，說明磁珠分選干細胞成功。
　　4.Transwell遷移實驗表明，穿越小室的CXCR4和CCR2表達陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量明顯較對照組多（248.

25、67±9.29vs135.33±11.37，P=0.000＜0.01，n=3）（圖4-4和圖4-5）。而CXCR4表達陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量與雙陽性細胞組比較，明顯少于后者（202.33±9.07vs248.67±9.29，P=0.02＜0.05，n=3）。同樣，CCR2表達陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量也明顯少于雙陽性細胞組（186.33±7.37vs248.67±9.29，P=0.002＜0.01，n=3）。說明通過磁珠分選

26、提高間充質(zhì)干細胞表面趨化因子受體CXCR4/CCR2的表達可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向靶位的遷移。
　　5.CSCs體內(nèi)歸巢實驗表明，以磁珠分選提高細胞表面趨化因子受體表達可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向分泌趨化因子的心肌歸巢(CXCR4+/CCR2+vscontrol，226.67±10.97vs123.33±10.26，P=0.003＜0.01，n=3)(圖4-8，圖4-9)。而CXCR4表達陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量與雙陽性細胞

27、組比較，明顯少于后者（199.0±10.54vs226.67±10.97，P=0.02＜0.05，n=3）。同樣，CCR2表達陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量也明顯少于雙陽性細胞組(112.0±14.0vs226.67±10.97，P＜0.01，n=3)，CXCR4陽性組細胞遷移數(shù)高于CCR2陽性組，且CCR2表達陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量與對照組相比差異不顯著（112.0±14.0vs123.33±10.26，P=0.314＞0.0

28、5，n=3）。體內(nèi)歸巢實驗的結(jié)果與體外Transwell遷移實驗的結(jié)果是一致的，再一次證實了磁珠分選獲得表達不同趨化因子受體的間充質(zhì)干細胞，因為SDF-1表達水平較高，SDF-1/CXCR4軸對于間充質(zhì)干細胞遷移歸巢的影響明顯要強于MCP-1/CCR2軸。
　　6.WB結(jié)果顯示，通過QuantityONE(V)4.6.7軟件以光密度積分值(IOD)對WesternBlot結(jié)果進行定量分析，結(jié)果顯示，下室加入趨化因子后，未分選細胞、

29、CXCR4+/CCR2+細胞、CXCR4+/CCR2-細胞、CXCR4-/CCR2+細胞的磷酸化Akt表達水平均上調(diào)，ser位點磷酸化抑制劑LY294002孵育細胞后pAkt表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　通過磁珠分選獲得的CXCR4/CCR2陽性細胞注射心梗小鼠心肌，能有效促進小鼠心功能改善，縮小梗死面積，其效果優(yōu)于未分選細胞，且CXCR4/CCR2陽性細胞的歸巢能力都顯著強于未分選細胞，其潛