小鼠眼部堿燒傷后骨髓間充質(zhì)干細胞歸巢到角膜組織的檢測及影響因素分析.pdf

1、摘要第一章小鼠堿燒傷完全性角膜緣干細胞功能失代償模型的建立及評價目的建立模擬臨床的小鼠堿燒傷完全性角膜緣干細胞功能失代償模型，為研究堿燒傷引發(fā)的完全性角膜緣干細胞功能失代償提供簡單、穩(wěn)定的動物模型。方法選取6—8周齡C57小鼠30只，全身麻醉后將浸有05mol／L氫氧化鈉溶液的環(huán)形濾紙片(內(nèi)徑3mm，外徑5ram)置于角膜緣30秒后取下，然后應(yīng)用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊30秒；術(shù)后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天及30天，應(yīng)用裂

2、隙燈顯微鏡觀察角膜上皮完整性、基質(zhì)透明性及新生血管化情況；每個時間點隨機抽取3只小鼠取材，進行組織病理學(xué)檢查；術(shù)后21天進行角膜免疫印跡細胞學(xué)檢查。結(jié)果①裂隙燈檢查：術(shù)后1天：角膜緣缺血，可見邊界清楚的灰白色環(huán)狀混濁區(qū)，大小與濾紙片直徑一致，全角膜水腫、上皮缺損；術(shù)后3—5天：角膜灰白色混濁，水腫加重；術(shù)后710天：角膜水腫逐漸減輕，上皮恢復(fù)完整；術(shù)后14天：角膜緣可見毛刷狀新生血管生長；術(shù)后21天：角膜緣較多新生血管長入角膜基質(zhì)；術(shù)后

3、30天：角膜混濁、新生血管化，部分模型發(fā)生瞼球粘連；②HE染色：術(shù)后卜5天：角膜上皮層、基質(zhì)層內(nèi)可見大量炎癥細胞浸潤，角膜基質(zhì)水腫、明顯增厚、膠原纖維排列不規(guī)則、較疏松；術(shù)后710天：角膜表面單層上皮覆蓋，基質(zhì)水腫逐漸減輕，炎癥細胞浸潤減少；術(shù)后14天：角膜表面覆蓋2—3層上皮細胞，基質(zhì)無明顯水腫，膠原纖維排列相對整齊；術(shù)后21天：角膜基質(zhì)內(nèi)較多新生血管增生，管腔內(nèi)有成熟紅細胞；術(shù)后30天：角膜上皮層內(nèi)可見較多杯狀細胞；③免疫印跡細胞學(xué)

4、檢查：角膜表面可見較多核大、核質(zhì)比例約1／2、嗜伊紅染色的杯狀細胞，PAS染色陽性，為結(jié)膜細胞表型。結(jié)論①應(yīng)用環(huán)形濾紙片堿燒傷的方法制作小鼠完全性角膜緣干細胞功能失代償模型，角膜表面可見較多杯狀細胞，裂隙燈檢查見小鼠角膜的體征符合臨床上“完全性角膜緣干細胞功能失代償”的診斷標準。②此方法操作簡單，易于重復(fù)，為下一步的在體研究提供了良好的動物模型。第三章眼表炎癥因子及高滲透壓環(huán)境對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)性狀的影響目的檢測眼表主要炎癥因

5、子(白介素一1B)及高滲透壓環(huán)境(4060sm)對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)、活細胞率、增殖及遷移能力等生物學(xué)性狀的影響。方法體外分離小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)，設(shè)置正常對照組、5ng／ml工L一1B組、10ng／mlIL一1B組、20ng／mlIL一1B組及高滲組，分別應(yīng)用MTT法、細胞克隆形成試驗、劃痕法進行檢測。結(jié)果①細胞形態(tài)：原代培養(yǎng)的細胞呈梭形，排列具有方向性，胞漿豐富，細胞核較大，呈圓形，位于細胞中央；5ng／mlIL一1B

6、組細胞形態(tài)無明顯差異；隨著培養(yǎng)基中IL一10濃度升高，出現(xiàn)較多漂浮細胞，細胞變小，多呈圓形；高滲組培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量漂浮細胞，貼壁細胞排列松散，形態(tài)不規(guī)則，失去梭形外觀，細胞膜皺縮，反光增強。②MTT法：正常對照組吸光度(0D值)為04980043(m5)；5ng／mlIL一10組0D值為04990038(JrF5)，與正常對照組相比，t=0035，P=0974，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；10ng／mlIL一1B組、20ng／mlIL一1B組及高

7、滲組oD值明顯減少，以高滲組為著，與正常對照組相比，tr=6209，阼0003，鏟8881，繆O001，t，=10146，Py0001，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；③細胞克隆形成試驗：正常對照組細胞能形成較多克隆，克隆形成率為18200192396(JrF3)；5ng／mlIL一1p組克隆形成率下降至17400i207496(n=3)，與正常對照組相比，t=0667，P=0541，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；10ng／mlIL一1B組、20ng／mlI

8、L一1B組及高滲組克隆形成率進一步減少，以高滲組為著，與正常對照組相比，tr=12348，只=0000，tyl7250，繆0000，鏟11943，序0000，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；④劃痕法：正常對照組細胞遷移能力旺盛，72小時全部越過劃痕；5ng／mlIL1B組細胞遷移能力未受明顯影響，72小時全部越過劃痕；10ng／mlIL一1B組、20ng／mlIL—lB組及高滲組24小時、48小時及72小時細胞遷移能力均明顯下降，以高滲組為著，與