多糖水凝膠結(jié)合間充質(zhì)干細胞治療大鼠角膜堿燒傷的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究通過建立離體角膜上皮細胞（corneal epithelial cells，CECs）損傷模型和大鼠角膜堿燒傷的動物模型，利用局部應用多糖結(jié)合間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的聯(lián)合療法作用于兩種模型，觀察CECs的增殖和遷移變化和大鼠角膜堿燒傷損傷的修復過程，比較多糖結(jié)合MSCs的聯(lián)合治療與單獨使用多糖及單獨使用MSCs治療效果的差異。探討和評估聯(lián)合多糖和MSCs治療對大

2、鼠角膜堿燒傷的療效，為角膜堿燒傷的臨床治療提供一種全新的治療策略。
　　1.多糖聯(lián)合MSCs能否比單獨使用多糖及單獨使用MSCs治療更能促進原代培養(yǎng)的CECs增殖和遷移。
　　2.多糖聯(lián)合MSCs能否比單獨使用多糖及單獨使用MSCs治療更能促進大鼠角膜堿燒傷后眼表的修復和重建。
　　研究方法：
　　1.培養(yǎng)大鼠原代CECs后，分別用多糖溶液、MSCs、多糖聯(lián)合MSCs作用于CECs，并利用MTT法檢測24h，48

3、h，72h各濃度對原代培養(yǎng)CECs增殖能力的影響。
　　2.培養(yǎng)大鼠原代CECs后，建立離體上皮細胞損傷模型（細胞劃痕實驗），分別用多糖溶液、MSCs、多糖聯(lián)合MSCs作用于CECs，并檢測24h各組對原代培養(yǎng)的CECs遷移能力的影響。
　　3.建立大鼠角膜堿燒傷動物模型，分別用多糖水凝膠、MSCs、多糖水凝膠聯(lián)合MSCs治療角膜堿燒傷，分別于治療后3d，7d，14d，28d觀察和評估角膜透明度、角膜上皮愈合度、新生血管數(shù)量

4、指標，并運用RT-PCR和ELISA方法檢測各種治療方法對大鼠角膜堿燒傷后角膜分泌的炎癥相關(guān)因TNF-α、TGF-beta，趨化因子MIP-1α、MCP-1，新生血管相關(guān)因子VEGF、MMP-2、TSP-1變化的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.在多糖濃度＜200ug/ml時，各濃度多糖對CECs的增殖能力的差異沒有統(tǒng)計學意義。在多糖濃度400ug/ml， CECs逐漸死亡。
　　2.細胞增殖實驗顯示，多糖組、MSCs組

5、、多糖MSCs聯(lián)合治療組與對照組在24h,48h時對CECs的增殖能力的差異沒有統(tǒng)計學意義，而MSCs組和多糖MSCs聯(lián)合治療組在72h時與對照組相比促進CECs增殖能力的差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.細胞劃痕實驗顯示，多糖、MSCs組、多糖MSCs聯(lián)合治療組與對照組在24h促進CECs遷移能力差異均具有統(tǒng)計學意義，聯(lián)合療法與單治療組促進CECs遷移的能力差異具有統(tǒng)計學意義。
　　4.多糖水凝膠應用于正常大鼠眼表未見明顯的副

6、反應存在。
　　5.大鼠角膜堿燒傷后，結(jié)膜下注射MSCs7天后可見MSCs大量存活，14天后仍可見少量存活。
　　6.動物模型實驗發(fā)現(xiàn)，多糖組、MSCs組、多糖MSCs聯(lián)合治療組與未治療組7天、14天、28天時提高角膜透明度差異均具有統(tǒng)計學意義，而聯(lián)合治療組與單治療組相比提高角膜透明度的差異具有統(tǒng)計學意義。
　　7.動物模型實驗發(fā)現(xiàn)，多糖組、MSCs組、多糖MSCs聯(lián)合治療組與未處理組在3天、7天、14天時促進上皮的愈

7、合能力的差異均具有統(tǒng)計學意義，聯(lián)合治療組與單治療組在7天、14天時促進角膜上皮愈合能力的差異具有統(tǒng)計學意義。
　　8.動物模型實驗發(fā)現(xiàn)，多糖組、MSCs組、多糖MSCs聯(lián)合治療組與未處理組在7天、14天、28天時抑制新生血管能力的差異均具有統(tǒng)計學意義，聯(lián)合治療組與單治療組在14天、28天時抑制新生血管能力的差異具有統(tǒng)計學意義。
　　9.大鼠角膜堿燒傷后各組角膜組織HE組織化學染色顯示:MSCs組傷后第3天，第7天時，角膜上皮

8、缺損區(qū)可見大皰狀改變，膠原纖維排列疏松，可見上皮層及基質(zhì)內(nèi)炎癥細胞浸潤。第14天時角膜上皮愈合，基質(zhì)水腫消失，可見基質(zhì)內(nèi)少量新生血管生成。多糖組傷后第3天，第7天時，角膜上皮缺損區(qū)未見大皰狀病變，可見上皮層及基質(zhì)內(nèi)炎癥細胞浸潤。第14天時角膜上皮愈合，可見基質(zhì)內(nèi)新生血管生成。而聯(lián)合治療組第3天時，角膜上皮缺損區(qū)未見大皰狀病變，可見極少量炎癥細胞浸潤。第7天時角膜上皮愈合。第14天時可見基質(zhì)內(nèi)極少量新生血管生成。
　　10.利用RT

9、-PCR方法對大鼠角膜堿燒傷治療后各組相關(guān)細胞因子的基因表達檢測顯示:多糖組、MSCs組、多糖MSCs聯(lián)合治療組與未處理組相比在各時間段下調(diào)TNF-α、MIP-1α、MCP-1，VEGF、MMP-2基因表達的差異均具有統(tǒng)計學意義，同時促進TSP-1、TGF-beta的表達上調(diào)的差異均具有統(tǒng)計學意義。多糖MSCs聯(lián)合治療與單治療組相比下調(diào)TNF-α，MIP-1α、MCP-1及VEGF、MMP-2的基因表達的差異具有統(tǒng)計學意義，上調(diào)TGF-

10、beta、TSP-1的基因表達差異具有統(tǒng)計學意義。
　　11.利用ELISA方法對大鼠角膜堿燒傷治療后各組相關(guān)細胞因子蛋白表達檢測顯示:多糖組、MSCs組、多糖MSCs聯(lián)合治療組與未處理組相比減少VEGF蛋白表達、促進TGF-beta蛋白表達的差異具有統(tǒng)計學意義。而多糖MSCs聯(lián)合治療組與單治療組相比減少VEGF蛋白表達，增加TGF-beta蛋白表達的差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1.在多糖濃度＜200ug/m

11、l時，在體及離體實驗均表明，不同濃度多糖與CECs均具有良好的生物相容性。
　　2.200ug/ml多糖溶液對原代培養(yǎng)的CECs的形態(tài)和增殖沒有影響，而MSCs在與CECs作用72h時能促進CECs的增殖。
　　3.多糖與MSCs均能促進CECs的24h遷移，而聯(lián)合處理組具有更佳的促進效果。
　　4.原代培養(yǎng)的MSCs能在大鼠堿燒傷后的結(jié)膜下存活14天左右。
　　5.多糖和MSCs均能提高大鼠角膜堿燒傷后角膜透明

12、度，促進角膜上皮的愈合，并抑制角膜新生血管的形成。而多糖MSCs聯(lián)合治療組提高角膜堿燒傷后角膜透明程度、角膜上皮愈合能力和抑制角膜新生血管的能力要顯著優(yōu)于MSCs或多糖單治療組。
　　6.多糖和MSCs均能通過下調(diào)炎癥因子TNF-α，趨化因子MIP-1α、MCP-1，新生血管因子VEGF、MMP-2的基因表達和VEGF蛋白表達，上調(diào)抗炎因子TGF-beta基因和蛋白表達、抗新生血管因子TSP-1的基因表達而達到抑制炎癥反應和新生血