大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向惡性黑色素瘤組織歸巢能力的探討.pdf

1、目的:惡性黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病率在皮膚科腫瘤中居于第三位，且呈逐年上升的態(tài)勢(shì)。惡性黑色素瘤的惡性程度較高，且多發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。患者的死亡率會(huì)隨著腫瘤侵襲的深度而增加。目前除了及早發(fā)現(xiàn)并行手術(shù)切除外，并無(wú)其他有效治療手段。但目前許多腫瘤在發(fā)現(xiàn)時(shí)多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，所以單純的手術(shù)切除很難達(dá)到根治的目的。而以放、化療為輔助手段的治療對(duì)惡性黑色素瘤收效甚微。所以尋求一種高效、安全的輔助治療手段正成為人類迫切的需求。近年來(lái)隨著對(duì)干細(xì)

2、胞研究的不斷深入，間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸走入了人們的視野。間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有組織來(lái)源豐富，易于體外擴(kuò)增并能向損傷以及腫瘤組織遷移的能力等特性[1]，所以間充質(zhì)干細(xì)胞是一種較為理想的載體，可以攜帶抗腫瘤藥物或者抑癌基因到達(dá)腫瘤組織，以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的治療作用。但間充質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤組織的歸巢還受到很多因素的影響，能到達(dá)靶組織的細(xì)胞數(shù)量對(duì)于治療的效果將起到?jīng)Q定性的作用。移植途徑的選擇是決定間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的首要因素。目前的細(xì)胞移植途徑主要有靜脈移植、

3、動(dòng)脈移植以及局部移植。通過(guò)靜脈移植較為安全，同時(shí)也利于干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移，但是肺部毛細(xì)血管的阻滯作用成為了影響間充質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤組織歸巢的首要因素[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立黑色素瘤裸鼠模型，通過(guò)靜脈途徑向荷瘤裸鼠以及正常裸鼠移植PKH26標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)荷瘤裸鼠腫瘤組織以及兩組裸鼠肺組織切片中熒光陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目，從而探討間充質(zhì)干細(xì)胞向黑色素瘤組織歸巢的能力，以及肺部毛細(xì)血管阻滯對(duì)其歸巢的影響。進(jìn)而通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)以間充質(zhì)干細(xì)胞為載體

4、的對(duì)腫瘤的靶向治療提供指導(dǎo)。
　　 方法:
　　 1以密度梯度離心法分離并純化大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且傳代培養(yǎng)。
　　 2通過(guò)誘導(dǎo)，讓所得到的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，以驗(yàn)證其作為干細(xì)胞具有多向分化的潛能。
　　 3黑色素瘤動(dòng)物模型的制備:向裸鼠的后下肢皮下注射裸鼠黑色素瘤細(xì)胞B16，制備黑色素瘤動(dòng)物模型。
　　 4應(yīng)用PKH26標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并計(jì)算標(biāo)記率。
　　

5、 5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將4周齡雌性裸鼠隨機(jī)分為A、B兩組每組各10只，A組通過(guò)皮下注射黑色素瘤細(xì)胞B16建立黑色素瘤裸鼠模型。2周后待A組裸鼠成瘤后通過(guò)鼠尾靜脈向兩組裸鼠移植PKH26標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞。讓裸鼠自由進(jìn)食水，觀察并記錄A組裸鼠的腫瘤直徑以及兩組裸鼠的狀態(tài)。
　　 6兩周后將裸鼠全部處死，取下A組裸鼠的腫瘤組織，以及A、B兩組裸鼠的肺組織，制作組織切片。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)組織切片中熒光陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量。
　　 7運(yùn)用統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)軟件SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1以密度梯度離心法分離純化的細(xì)胞，可逐步得到呈長(zhǎng)梭形放射狀排列的細(xì)胞。
　　 2通過(guò)誘導(dǎo)，所得到的間充質(zhì)干細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞以及神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。
　　 3經(jīng)皮下注射黑色素瘤細(xì)胞的裸鼠，1周后成瘤，2周后腫瘤直徑最大1cm最小0.6cm，裸鼠略顯消瘦但活力正常。
　　 4PKH26標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞胞膜呈均勻的紅色熒光，標(biāo)記率為100％，且子

7、代也帶有熒光。PKH26標(biāo)記后細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖未受影響。
　　 5間充質(zhì)干細(xì)胞移植2周后兩組裸鼠均存活。A組裸鼠皮下最小1.2cm，脂肪基本消失，呈惡病質(zhì)狀態(tài)，A組裸鼠腫瘤直徑最大2.4cm，部分腫瘤組織的頂端出現(xiàn)不同程度的(被)潰。B組裸鼠未見明顯異常。
　　 6A組裸鼠腫瘤組織切片中熒光陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)平均為為9.9個(gè)，且與A組裸鼠腫瘤組織的直徑呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.976，（P值為0.00＜0.05）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。