小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與惡性黑色素瘤細(xì)胞體外共培養(yǎng)環(huán)境中相互作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：研究惡性黑色素瘤細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSC)間的相互作用及作用機(jī)制，從而進(jìn)一步明確惡性黑色素瘤血管形成機(jī)制中內(nèi)皮細(xì)胞來源和惡性黑色素瘤細(xì)胞多種因子表達(dá)情況及間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)其表達(dá)的影響，豐富腫瘤局部微循環(huán)建立模式的相關(guān)理論，并為惡性黑色素瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)自分泌機(jī)制和正反饋環(huán)路的研究提供一定的理論依據(jù)。 方

2、法：通過四肢長(zhǎng)骨分離和骨髓腔沖洗得到骨髓，應(yīng)用貼壁篩選等細(xì)胞篩選方法，選取適當(dāng)血清濃度、細(xì)胞接種密度等細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增培養(yǎng)，通過倒置相差光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞光鏡下形態(tài)，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法，通過倒置熒光顯微鏡、倒置相差光學(xué)顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)觀察并檢測(cè)CD44、CD105、CD34和CD45等指標(biāo)的染色結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。 通過體外進(jìn)行MSC細(xì)胞的單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)和與惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞

3、)的非接觸式共培養(yǎng)，應(yīng)用倒置相差光學(xué)顯微鏡對(duì)比觀察和分析單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)和非接觸式共培養(yǎng)條件下的MSC細(xì)胞光鏡下形態(tài)，通過激光掃描共聚焦顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、倒置相差光學(xué)顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)觀察和檢測(cè)CD44、CD105、CD34、CD45、Ⅷ因子、VEGFR-1和VEGFR-2等7種指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以明確兩組間7種指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的差異和觀察透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化，以及通過激光掃描共聚焦顯微

4、鏡、倒置熒光顯微鏡、倒置相差光學(xué)顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)觀察和檢測(cè)MSC細(xì)胞和與惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)在非接觸式共培養(yǎng)條件下的惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)的VEGF及其受體等指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，進(jìn)而對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞與MSC細(xì)胞的相互作用進(jìn)行判斷。 通過體外進(jìn)行惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)和與MSC細(xì)胞的接觸式和非接觸式共培養(yǎng)，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、倒置相差光學(xué)顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)對(duì)

5、比觀察和分析單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)、接觸式和非接觸式共培養(yǎng)三種實(shí)驗(yàn)條件下的B16細(xì)胞的VEGF及其受體VEGFR-1和VEGFR-2等5種指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以明確各組間5種指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的差異，進(jìn)而對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性和MSC對(duì)其產(chǎn)生的影響進(jìn)行觀測(cè)。 結(jié)果：經(jīng)過分離和擴(kuò)增培養(yǎng)得到具有克隆樣生長(zhǎng)和成纖維樣細(xì)胞形態(tài)等特征的緊密貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，通過細(xì)胞表型鑒定和對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，表明C

6、D44強(qiáng)陽性(平均陽性率93.1％)，CD105陽性(平均陽性率79.2％)，CD34陰性(平均陽性率4.7％，免疫熒光陰性)，CD45陰性(平均陽性率6.2％，免疫熒光陰性)。 體外進(jìn)行MSC細(xì)胞的單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)和與惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)的非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組中MSC光鏡下部分細(xì)胞為多角形或短梭形，邊界清晰，大小較均勻，胞核圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，可見1～2個(gè)清晰的細(xì)胞核，少數(shù)細(xì)胞較密集

7、區(qū)域，呈典型的單層鋪路石樣鑲嵌排列；②免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組MSC細(xì)胞呈CD44強(qiáng)陽性(平均陽性率93.1％)，CD105陽性(平均陽性率79.0％)，CD34陰性(平均陽性率4.8％，免疫熒光陰性)，CD45陰性(平均陽性率6.1％，免疫熒光陰性)，Ⅷ因子陰性(平均陽性率5.5％，免疫熒光陰性)，VEGFR-2陰性(平均陽性率4.5％，免疫熒光陰性)，VEGFR-1陰性(平均陽性率5.8％，免疫熒光陰性)，非接觸式共培

8、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組MSC細(xì)胞呈CD44陽性(平均陽性率73.9％)，CD105陽性(平均陽性率62.3％)，CD34陽性(平均陽性率50.9％，免疫熒光陽性)，CD45弱陽性(平均陽性率17.2％，免疫熒光弱陽性，部分孔陰性)，Ⅷ因子陽性(平均陽性率42.2％，免疫熒光陽性)，VEGFR-2弱陽性(平均陽性率31.8％，免疫熒光陽性)，VEGFR-1陽性(平均陽性率29.7％，免疫熒光陽性)，通過統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明共培養(yǎng)組與對(duì)照組在CD44、CD1

9、05、CD34、CD45、Ⅷ因子、VEGFR-1和VEGFR-2這7個(gè)指標(biāo)上有顯著差異(P＜0.01)；③透射電鏡下，非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組中部分細(xì)胞胞體內(nèi)可見到Weible-Palade小體：橫截面呈圓形，包膜內(nèi)可見到數(shù)量不等的微管橫斷面，縱截面呈卵圓形，沿長(zhǎng)軸可見微管縱剖面，有的細(xì)胞胞質(zhì)突起較長(zhǎng)，突起之間或突起與胞膜之間有連接結(jié)構(gòu)存在，胞質(zhì)突起內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)的外胞漿帶可見有豐富的微絲存在，有的細(xì)胞局部胞膜外可見少量基膜物質(zhì)；④非接觸式共培

10、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組B16細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示VEGF-a強(qiáng)陽性(平均陽性率93.6％，免疫熒光陽性)，VEGF-b陰性(平均陽性率4.6％，免疫熒光陰性)，VEGFR-2陽性(平均陽性率89.4％，免疫熒光陽性)，VEGFR-1陽性(平均陽性率83.0％，免疫熒光陽性)。 體外進(jìn)行惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)和與MSC細(xì)胞的接觸式和非接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①B16單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組中細(xì)胞呈現(xiàn)VEGF-a強(qiáng)陽性(平均陽

11、性率91.7％，免疫熒光陽性)，VEGFR-2陽性(平均陽性率90.4％，免疫熒光陽性)，VEGFR-1陽性(平均陽性率81.8％，免疫熒光陽性)，Ⅷ因子陽性(平均陽性率90.3％，免疫熒光陽性)，VEGF-b陰性(平均陽性率5.1％，免疫熒光陰性)；②MSC與B16接觸式共培養(yǎng)組中B16細(xì)胞呈現(xiàn)VEGF-a弱陽性(平均陽性率31.5％，免疫熒光陽性)，VEGFR-2弱陽性(平均陽性率22.4％，免疫熒光陽性)，VEGFR-1弱陽性(平

12、均陽性率26.1％，免疫熒光陽性)，Ⅷ因子弱陽性(平均陽性率33.8％，免疫熒光陽性)，VEGF-b陰性(平均陽性率5.8％，免疫熒光陰性)；③MSC與B16非接觸式共培養(yǎng)組中B16細(xì)胞呈現(xiàn)VEGF-a強(qiáng)陽性(平均陽性率91.0％，免疫熒光陽性)，VEGFR-2陽性(平均陽性率87.5％，免疫熒光陽性)，VEGFR-1陽性(平均陽性率86.2％，免疫熒光陽性)，Ⅷ因子陽性(平均陽性率90.2％，免疫熒光陽性)，VEGF-b陰性(平均陽性

13、率4.9％，免疫熒光陰性)；④對(duì)比并分析MSC與B16接觸式共培養(yǎng)組，MSC與B16非接觸式共培養(yǎng)組和B16單獨(dú)培養(yǎng)組三組間各個(gè)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，表明接觸式共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在VEGF-a、VEGFR-2、VEGFR-1、Ⅷ因子這4個(gè)指標(biāo)上有顯著差異(P＜0.01)，在VEGF-b上無差異(P＞0.05)；非接觸式共培養(yǎng)組和接觸式共培養(yǎng)組兩組在VEGF-a、VEGFR-2、VEGFR-1、Ⅷ因子這4個(gè)指標(biāo)上有顯著差異(P＜0.01)，在V

14、EGF-b上無差異(P＞0.05)；非接觸式共培養(yǎng)組和對(duì)照組在VEGF-a、VEGF-b、VEGFR-2、VEGFR-1、Ⅷ因子這5個(gè)指標(biāo)上均無差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1本研究通過采用貼壁篩選等細(xì)胞篩選方法和適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)條件，成功分離和擴(kuò)增培養(yǎng)得到符合克隆樣生長(zhǎng)和成纖維樣細(xì)胞等形態(tài)特征，并且具有間充質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞表型特性的緊密貼壁生長(zhǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2本研究通過體外進(jìn)行MSC細(xì)胞的單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)和與惡性黑

15、色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)的非接觸式共培養(yǎng)，初步證實(shí)與B16共培養(yǎng)的MSC中部分細(xì)胞表型發(fā)生改變，表明MSC中30％～40％細(xì)胞發(fā)生向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化；參照非接觸式共培養(yǎng)組的B16細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，初步推測(cè)B16細(xì)胞向共同培養(yǎng)體系中分泌的VEGF-a等因子起到促進(jìn)MSC分化的作用，導(dǎo)致MSC的向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。因此，本研究提出在體外環(huán)境中MSC受到腫瘤分泌的VEGF等因子的誘導(dǎo)，分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤誘導(dǎo)MSC分化理論，并且推

16、測(cè)誘導(dǎo)分化生成的血管內(nèi)皮細(xì)胞可能參與腫瘤血管發(fā)生或血管生成。腫瘤誘導(dǎo)MSC分化理論的提出，讓我們重新認(rèn)識(shí)了MSC在腫瘤血管形成中的作用，豐富腫瘤局部微循環(huán)建立模式的相關(guān)理論。。 3本研究通過體外進(jìn)行惡性黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)單獨(dú)對(duì)照培養(yǎng)和與MSC細(xì)胞的接觸式和非接觸式共培養(yǎng)，初步表明體外培養(yǎng)環(huán)境中缺氧情況下，惡性黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)的VEGF可通過VEGFR-1和VEGFR-2介導(dǎo)的自分泌途徑促進(jìn)自身增殖和多種因子的表達(dá)，并且可