骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其向腫瘤局部歸巢機(jī)制的初步探索.pdf

1、第一部分
　　 【研究背景及目的】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多能分化潛能的細(xì)胞，可以向骨組織，心肌，軟骨組織，肌肉等分化，并且可以特異遷移到損傷部位及腫瘤局部，被認(rèn)為是具有應(yīng)用前景的基因治療細(xì)胞載體。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞靶向歸巢腫瘤局部的機(jī)制卻不太清楚。本研究在于分離人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），并探討其體內(nèi)靶向歸巢腫瘤局部的機(jī)制。
　　 【方法】(1）密度梯度離心法獲得骨

2、髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并體外培養(yǎng)擴(kuò)增。（2）流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD44、CD105、CD90、CD34、CD45、CD19；不同條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化、軟骨分化及脂肪分化，倒置顯微鏡觀察。（3）建立小鼠原位乳腺腫瘤模型，尾靜脈注射菲力磁（SPIO）體外標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用冰凍切片對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠腫瘤局部的分布情況進(jìn)行檢測。（4）取新鮮乳腺癌組織，剪碎，膠原酶消化成單細(xì)

3、胞懸液，細(xì)胞標(biāo)記抗CD31單克隆抗體，免疫磁柱分離抗CD31單克隆抗體陽性細(xì)胞，即腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且體外原代培養(yǎng)。（5）流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性分子CD31、CD34、vWF。（6）Transwell模型驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞的體外趨化能力。（7）Transwell模型血管內(nèi)皮細(xì)胞對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外趨化能力，結(jié)晶紫染色，顯微鏡照相，每個(gè)濾膜隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，穿膜細(xì)胞數(shù)表示骨

4、髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外遷移能力。
　　 【結(jié)果】(1）原代貼壁細(xì)胞呈長梭形。體外培養(yǎng)一周，細(xì)胞形態(tài)均一，擴(kuò)增速度快，克隆形成能力強(qiáng)。（2）流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物CD44、CD105、CD90陽性率分別為99.79±3.35％，99.62±3.78％，98.93±3.62％，陰性標(biāo)志物CD34、CD45、CD19為4.32±1.01％,4.04±1.05％,6.04±0.95％；激光共聚焦顯微鏡下，可見骨髓

5、間充質(zhì)干細(xì)胞陽性標(biāo)志物在細(xì)胞內(nèi)存在較高表達(dá)。不同的條件培養(yǎng)液成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨組織、脂肪組織及軟骨組織分化，驗(yàn)證了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能。（3）體外SPIO標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，細(xì)胞主要聚集在腫瘤局部。（4）免疫磁珠方法分離的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，6-12小時(shí)貼壁生長，早期細(xì)胞呈小多角、球形，逐漸生長成梭形，于3～4d后融合，為單層呈鋪路石狀排列。（5）流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，CD31、CD34、v

6、WF陽性率分別為92.8±2.32％，99.87±1.95％,86.26±2.57％（6）Boyden小室結(jié)果顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)，下室接種MDA-MB-231及MDA-MB-435s細(xì)胞組與對照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯改變。（7）Boyden小室結(jié)果顯示：腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞組，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組（p﹤0.05）
　　 【結(jié)論】體外可獲得較高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，且易于培養(yǎng)擴(kuò)增。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)靶向歸巢腫

7、瘤局部的能力與腫瘤局部血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。
　　 第二部分
　　 目的：研究Snail與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移間的關(guān)系，并探討其分子機(jī)制。
　　 方法：構(gòu)建正義全長Snail 真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系Hela、Siha。采用Westernblot 方法分析相關(guān)基因表達(dá)，細(xì)胞傷痕愈合實(shí)驗(yàn)，Transwell模型穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)果：(1)在轉(zhuǎn)染PEGFPC1/Snail的宮頸癌細(xì)胞株H

8、ela、SiHa中E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào),Snail和Vimentin 則表達(dá)上調(diào)（p＜0.05）。(2)宮頸癌細(xì)胞系Hela、Siha 轉(zhuǎn)染正義全長Snail 真核表達(dá)載體，12小時(shí)細(xì)胞傷痕愈合能力顯著提高（p＜0.05）；轉(zhuǎn)染PEGFPC1/Snail后，Hela、SiHa細(xì)胞12小時(shí)穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多（p＜0.05）。Snail過表達(dá)可顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞株Hela、SiHa的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子S