骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其經(jīng)明膠海綿搭載向神經(jīng)組織移植的初步研究.pdf

1、第一部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及其自身特性的初步研究。
　　 目的：通過本實驗，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)、鑒定并對其自身特性加以研究，同時為下一步明膠海綿載體搭載移植實驗提供搭載細(xì)胞。
　　 方法：首先，利用差速貼壁培養(yǎng)法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從大鼠的骨髓之中分離、純化出來。之后，利用流式細(xì)胞學(xué)方法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物加以鑒定。在鑒定其為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，以C6細(xì)胞系做為對照繪制其在不同代數(shù)

2、時期的生長曲線，對其致瘤性加以研究。利用免疫熒光學(xué)的方法，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下自發(fā)向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特性。利用Transwell方法，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向受損神經(jīng)組織定向遷移的特性。最后，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞簡便的凍存與復(fù)蘇保存方法。
　　 結(jié)果：從大鼠骨髓腔中沖出的混雜細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下顯示為大量單個或成團均勻分布的小圓形細(xì)胞。4～8小時之后部分細(xì)胞沉降并鋪至培養(yǎng)皿底部。24小時后觀察可見鋪于培養(yǎng)皿底部的大

3、部分細(xì)胞變扁并逐漸伸出突起。3天后未貼壁細(xì)胞及其它髓腔內(nèi)物質(zhì)經(jīng)換液被大部分去除。此后貼壁細(xì)胞不斷擴增，至10～14天可見大量細(xì)胞匯集成片，形態(tài)不一，成團生長。其中可見大扁平形、多角形、星形、梭形等多種細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)過傳代細(xì)胞形態(tài)和類型逐漸趨向單一，至第5代細(xì)胞大小一致，形態(tài)呈梭形，己基本得到純化。利用流式細(xì)胞學(xué)方法的檢測，細(xì)胞體系表達(dá)表面標(biāo)志物CD31、CD34、CD45為陰性，表達(dá)表面標(biāo)志物CD71為陽性。對其不同時期的生長曲線與C6細(xì)

4、胞系相比較，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線有很明顯的壓低。通過倒置相差顯微鏡的觀察和免疫熒光學(xué)的檢測，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下可自發(fā)分化出神經(jīng)樣細(xì)胞并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、NSE。通過Transwell實驗，可以觀察到在相同的時間內(nèi)損傷組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穿過率明顯高于對照組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的穿過率，經(jīng)統(tǒng)計P<0.05有顯著差異。經(jīng)過簡便方法凍存的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在-80℃條件下至少可以存活3個月，在液氮中保存則至少可以存活半年。

5、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后數(shù)量會有較大的損失，但只要復(fù)蘇后存活的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到一定的數(shù)量和密度，這些細(xì)胞仍可迅速擴增并在較短的時間內(nèi)獲得大量、穩(wěn)定，可以利用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 結(jié)論：通過最常應(yīng)用的差速貼壁培養(yǎng)法可以很穩(wěn)定地培養(yǎng)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，第5代細(xì)胞已達(dá)到純化要求。通過細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定可以確定其為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。10代以內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞致瘤性極小或者不存在，可以自發(fā)分化出神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。另外，

6、其具有獨特的歸巢性可向受損的神經(jīng)組織遷移。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過簡便的凍存與復(fù)蘇方法能夠在較長時間內(nèi)穩(wěn)定的保存，可為后續(xù)應(yīng)用提供儲備細(xì)胞。
　　 第二部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)明膠海綿載體搭載向神經(jīng)組織移植可行性的初步研究。
　　 目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被明膠海綿載體搭載后其存活率是否受到影響和其自身特性有否改變，并進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過明膠海綿載體搭載后能否與神經(jīng)細(xì)胞共存。
　　 方法：首先，觀察經(jīng)明膠

7、海綿搭載后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)有否改變并統(tǒng)計經(jīng)明膠海綿搭載移植后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁存活的數(shù)量與未經(jīng)搭載細(xì)胞相比是否有差異。然后，以未經(jīng)搭載第5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對照繪制經(jīng)過搭載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線，并對其致瘤性加以研究。之后誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，觀察經(jīng)過搭載的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與未經(jīng)搭載的細(xì)胞在誘導(dǎo)之后形態(tài)的不同，并統(tǒng)計二者所分化出的神經(jīng)元比例是否有差異。最后，建立體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系，并通過倒置相差顯微鏡研究觀察經(jīng)明膠海

8、綿搭載后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能否與神經(jīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)。
　　 結(jié)果：倒置相差顯微鏡觀察，明膠海綿組與對照組相比較細(xì)胞的形態(tài)未有明顯變化，多呈長梭形，扁平老化的現(xiàn)象也很少見。無論是在明膠海綿中部或是邊緣部均有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁，而且在明膠海綿中部貼壁的細(xì)胞數(shù)量更多一些。通過對明膠海綿組和對照組未貼壁細(xì)胞的計數(shù)比較P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)搭載后的第5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線與未經(jīng)搭載第5代細(xì)胞的生長曲線相比較沒有觀察到明顯的

9、變化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)6～8小時后可以觀察到細(xì)胞胞體開始收縮并伸出突起，部分突起相互連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)免疫熒光學(xué)檢測細(xì)胞可表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物NSE。通過流式細(xì)胞學(xué)方法對明膠海綿組與對照組表達(dá)NSE陽性率做比較，經(jīng)統(tǒng)計P>0.05，無顯著差異。新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞種植后12～24小時后大部分細(xì)胞可貼壁并伸出突起。隨著培養(yǎng)時間的延長神經(jīng)元胞突主干和分枝明顯延長形成稠密的網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量則不斷增長。原