rhVEGF165通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號途徑抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　 隨著人口逐漸老齡化,缺血性腦血管病的發(fā)病率逐年增高,目前已成為威脅人類生命的最主要疾病之一,其中腦梗死約占全部腦卒中的80％,腦梗死治療的關(guān)鍵是減輕缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡,已有實驗證實VEGF有減輕腦缺血區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用但其抗凋亡作用的機制還有待進一步研究。本實驗研究人重組血管內(nèi)皮細胞生長因子(rhVEGF165)通過調(diào)節(jié)P13K/Akt信號通路對氧糖剝奪(OGD,oxygen glucose deprivati

2、on)誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞(人神經(jīng)母細胞瘤細胞)凋亡的影響,明確VEGF是否通過上調(diào)P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的p-Akt的表達,減少cleaved caspase-3的表達來抑制缺血缺氧神經(jīng)細胞的凋亡,探討VEGF對缺血缺氧神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用的可能機制。
　　 實驗方法：
　　 用含10％胎牛血清和HEPES液(終濃度10mmol/L)改良的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細胞,每2-3天換液,取傳代后3天

3、的SH-SY5Y細胞,分為5組,A組(正常對照組);B組(OGD組):細胞缺血缺氧4小時,恢復(fù)氧和血清供給24小時;C組(VEGF干預(yù)組):細胞在氧糖剝奪(同B組條件)前30分鐘加入rhVEGFl65(濃度為100ng/mL);D組(LY294002干預(yù)組):細胞在氧糖剝奪(同B組條件)前30分鐘加入LY294002(濃度為50umol/L);E組(VEGF+LY294002雙干預(yù)組):細胞在氧糖剝奪(同B組條件)前30分鐘同時加入LY

4、294002(濃度為50umol/L)及VEGF(濃度為100ng/mL)。采用ArmexinV-FITC/PI雙染流式細胞分析儀檢測細胞凋亡率,應(yīng)用免疫熒光染色和Western-Blotting法檢測p-Akt和cleaved caspasc-3的蛋白表達水平,觀察rhVEGF165對氧糖剝奪的SH-SY5Y細胞的保護作用及對P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p-Akt、cleaved easpase-3表達的影響。
　　 實驗結(jié)

5、果：
　　 一、SH-SY5Y細胞凋亡結(jié)果。
　　 氧糖剝奪后,B、C、D、E組細胞凋亡率均較A組(正常對照組)顯著增高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)細胞凋亡率較B組(OGD組)顯著減少,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)細胞凋亡率較B組(OGD組)顯著增高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);E組(VEGF+LY294002雙干預(yù)組)細胞凋亡率較C組(VEGF干預(yù)

6、組)增高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 二、免疫熒光結(jié)果。
　　 實驗各組均見p-Akt的表達,均以胞漿表達為主,偶見胞核表達,比較各組SH-SY5Y細胞熒光強度B組(OGD組)高于A組(正常對照組),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)熒光強度高于B組(OGD組)(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)熒光強度明顯低于B組(OGD組)(p＜0.05);E組(VEGF+LY2940

7、02雙干預(yù)組)熒光強度顯著低于C組(VEGF干預(yù)組)(p＜0.05)。實驗各組均見cleaved caLspase-3的表達,均以胞漿表達為主,比較各組SH-SY5Y細胞熒光強度B組(OGD組)顯著高于A組(正常對照組),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)熒光強度明顯低于B組(OGD組)(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)熒光強度明顯高于B組(OGD組)(p＜0.05);E組(VEGF+LY294002

8、雙干預(yù)組)熒光強度顯著高于C組(VEGF干預(yù)組)(p＜0.05)。
　　 三、蛋白免疫印跡結(jié)果。
　　 實驗各組均見p-Akt的蛋白表達,B組(OGD組)p-Akt蛋白表達水平高于A組(正常對照組),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)p-Akt蛋白表達水平高于B組(OGD組),(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)p-Akt蛋白表達水平低于B組(OGD組),(p＜0.05);E組(VEGF

9、+LY294002雙干預(yù)組)p-Akt蛋白表達水平低于C組(VEGF干預(yù)組),(p＜0.05)。實驗各組均見cleaved caspase-3的表達,B組(OGD組)cleaved caspase-3的蛋白表達水平明顯高于A組(正常對照組),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)cleaved caLspase-3的蛋白表達水平明顯低于B組(OGD組),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)c

10、leaved caspase-3的蛋白表達水平明顯高于B組(OGD組),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);E組(VEGF+LY294002雙干預(yù)組)cleaved caspase-3的蛋白表達水平明于高于C組(VEGF干預(yù)組),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 VEGF可減少氧糖剝奪后SH-SY5Y細胞的凋亡,增加p-Akt的表達,減少cleaved caspase-3的表達,而LY294002(P