Bcl-xl基因?qū)ο跗这c誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡的抑制作用.pdf

1、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，生理水平的NO是一種胞內(nèi)信使分子，對維持正常生理活動有著重要的作用。高濃度的NO可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化、腦血管病等。研究認為，NO既可以誘導(dǎo)細胞凋亡，也可以引發(fā)細胞壞死，其中，凋亡又為主要途徑。因此選擇阻斷這種凋亡途徑從而改變疾病的進程為本實驗的根本目的。 基因治療即是指將治療基因遞送至細胞內(nèi)，通過基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、最后由合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)生治療效應(yīng)。在

2、基因治療中，安全、有效的目的基因是關(guān)鍵。以往，抗凋亡基因研究多集中在Bcl—2上，但仍有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入Bcl—2基因后并沒有抑制細胞凋亡，反而促進了凋亡，他們認為Bcl—2在不同細胞中凋亡的作用是有差別的。Bcl—xl的結(jié)構(gòu)和Bcl—2相似，在多種細胞中扮演抑制凋亡角色。國內(nèi)外已有學(xué)者將其應(yīng)用于抗神經(jīng)細胞凋亡的各種研究中，并取得良好效果。Gonzalez—Garcia M等研究還發(fā)現(xiàn)Bcl—2在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達水平明顯較Bcl—

3、xl低很多，他們認為，Bcl—x蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護神經(jīng)元方面可能發(fā)揮著重要的作用。因此，本研究選擇Bcl—xl基因作為研究對象，探索其對抗NO毒性的作用。 在模型的選擇上，考慮到人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的難接近性及原代培養(yǎng)神經(jīng)元的不可增殖性，研究中最終選擇人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH—SY5Y細胞做為工具。SY5Y是來源于人神經(jīng)母細胞瘤的細胞，其細胞形態(tài)、生理和系列化功能與正常神經(jīng)細胞相似，適合于作為神經(jīng)損傷細胞模型，被廣泛的用于中樞神經(jīng)

4、系統(tǒng)疾病研究。 本課題從人類胎盤組織中克隆出抗凋亡基因Bcl—xl，構(gòu)建出真核細胞表達載體pIRES2-EGFP/Bcl—xl，觀察它對硝普鈉誘導(dǎo)的SH—SY5Y細胞凋亡是否具有抑制作用，旨在探索Bcl—xl基因阻斷NO細胞凋亡損傷的途徑。 本課題內(nèi)容分為三部分： 第一章真核表達載體pIRES2-EGFP/Bcl—xl的構(gòu)建和鑒定 目的：獲取人類抗凋亡基因Bcl—xl，構(gòu)建Bcl—xl真核表達質(zhì)粒。

5、 方法： 1、根據(jù)人Bcl—xl基因序列自行設(shè)計引物，從人類胚胎組織中提取總RNA，RT—PCR獲得Bcl—xl cDNA并擴增后，TA克隆，與T載體連接，再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細菌，擴增、提取質(zhì)粒，測序鑒定。 2、選用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切T載體質(zhì)粒，回收Bcl—xl片段，與含綠色熒光蛋白基因的pIRES2-EGFP質(zhì)粒連接，再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細菌，擴增、提取質(zhì)粒，電泳、測序鑒定。 結(jié)果： 克

6、隆的Bcl—xl基因經(jīng)酶切和測序鑒定正確，并成功與pIRES2-EGFP質(zhì)粒連接，構(gòu)建真核表達載體pIRES2-EGFP/Bcl—xl。 第二章脂質(zhì)體對SH—SY5Y細胞轉(zhuǎn)染效率及其毒性觀察 目的：觀察pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒借助Lipofectamine2000對SH—SY5Y細胞的轉(zhuǎn)染效率及脂質(zhì)體對該細胞的毒性作用。 方法： 1、SH—SY5Y細胞于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培

7、養(yǎng)，在5％的CO2、37℃條件下培養(yǎng)。 2、利用Lipo fectamine2000在細胞匯合度70％時行轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒pIRES2-EGFP/Bcl—xl轉(zhuǎn)染入SH—SY5Y細胞。 3、轉(zhuǎn)染后48h，通過倒置熒光顯微鏡觀測質(zhì)粒在細胞中的轉(zhuǎn)染效果。 4、細胞轉(zhuǎn)染后，利用流式細胞儀檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。 5、實驗分三組：未轉(zhuǎn)染組、pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。

8、設(shè)定正常對照組細胞存活率為100％，其余各組光密度值與之相比得到各自的MTT細胞存活率。 結(jié)果： 1、以未轉(zhuǎn)染組MTT吸光度為對照，將pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組進行MTT檢測，發(fā)現(xiàn)三者細胞存活率無明顯差別(P>0.05)。 2、顯微鏡下觀察，經(jīng)流式細胞儀檢測，轉(zhuǎn)染效率約為63％。 第三章Bcl-xl基因?qū)ο跗这c誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡抑制作用的觀察

9、 目的：1、觀察硝普鈉對SH—SY5Y細胞的影響； 2、觀察Bcl—xl基因轉(zhuǎn)染入SH—SY5Y細胞后對硝普鈉作用的抑制。 方法： 1、硝普鈉(SNP)處理細胞：分別用不同濃度的(200umol/L、100umol/L、50umol/L、0umol/L)SNP作用SH—SY5Y細胞24 h，觀察各組濃度SNP對細胞的影響，送流式細胞儀檢測。并選取50 umol/L為實驗濃度。 2、細胞轉(zhuǎn)染并分組：

10、本實驗設(shè)A：正常組、B： pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、C：pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，各組細胞生長48h后，分別用50 umol/L SNP行藥物誘導(dǎo)。 3、SNP作用各組細胞24h后，Hoechst33258染色后觀察核染情況。 4、MTT比色法測定各組細胞活性，設(shè)定對照組為正常細胞，未轉(zhuǎn)染，未加藥物，存活率為100％，余各組光密度值與之相比得到各自的MTT細胞存活率。 5、提取C組

11、轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后48h、轉(zhuǎn)染后72h、轉(zhuǎn)染后96h細胞總RNA，行RT—PCR法檢測細胞轉(zhuǎn)染后Bcl—xl基因的mRNA轉(zhuǎn)錄情況。 6、提取C組轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后48h、轉(zhuǎn)染后72h、轉(zhuǎn)染后96h細胞總蛋白，用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后細胞蛋白表達情況。 結(jié)果： 1、光鏡下可以觀察到，隨著SNP濃度的升高，細胞突起回縮或斷裂，胞體固縮，呈圓點狀，網(wǎng)絡(luò)消失；流式細胞儀檢測也發(fā)現(xiàn)

12、，凋亡率逐漸增高，并與濃度有正相關(guān)依賴性。與MTT結(jié)果相一致。 2、熒光顯微鏡下觀察，Hoechst33258染色后，正常細胞核呈藍色或淡藍色，著色均勻；而50umol/L SNP作用的細胞(包括未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)染色后發(fā)現(xiàn)約30％為凋亡細胞(與流式細胞結(jié)果相符)：呈核濃染，核固縮或為典型的凋亡小體；而pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組則凋亡細胞明顯減少，僅小部分胞核呈濃染狀，約10％左右。 3、在SN

13、P作用后，各組細胞行MTT檢測，pIRES2-EGFP/Bcl—xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞存活率比正常組和pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組都要高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05；而正常組和pIRES2-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間存活率則無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。 4、RT—PCR結(jié)果：未轉(zhuǎn)染組有很微弱的電泳帶，轉(zhuǎn)染24h以后時間點電泳帶都明顯增強，而其中轉(zhuǎn)染后48h最強，均在700bp附近。 5、Western blott

14、ing結(jié)果：未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染24h組，轉(zhuǎn)染48h組可見弱爆光帶，強度一致，而轉(zhuǎn)染72h組，轉(zhuǎn)染96h組見較前三組明顯增強爆光帶，其中轉(zhuǎn)染72h組亮度最強，位于32KD左右。同時，各組間β—actin強度一致。 結(jié)論： 1、證實硝普鈉(SNP)對SH—SY5Y細胞具有凋亡效應(yīng)，而且與劑量有正相關(guān)依賴性。 2、Bcl—xl基因在SH—SY5Y細胞中有弱表達，將構(gòu)建質(zhì)粒pIRES2-EGFP/Bcl—xl轉(zhuǎn)染入該細胞后4