ANKIB1對SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用及CnAα4的功能分析.pdf

1、背景：
　　神經(jīng)退行性疾病的治療在臨床上缺少有效的方法，因此需要尋找新的與神經(jīng)保護相關的分子靶點。鈣調神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CN)是目前唯一受Ca2+和鈣調蛋白(calmodulin，CaM)調控的蛋白磷酸酶，由催化亞基CnA和調節(jié)亞基CnB組成，能夠活化活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)，與細胞凋亡有著密切的關系。含錨蛋白重復序列和IBR結構域蛋白1

2、（ankyrin repeat and IBR domaincontaining1，ANKIB1）含有一個CN的結合位點，其與細胞凋亡之間的關系尚缺乏研究。CnAα4是一種新的人CnA1轉錄本，其編碼蛋白的功能未見報道。
　　目的：
　　1、探索ANKIB1對SH-SY5Y細胞凋亡的影響及可能機制;
　　2、揭示CnAα4的功能。
　　方法：
　　1、Western印跡檢測ANKIB1對SH-SY5Y細胞凋

3、亡的影響
　　將pCMV-Myc-ANKIB1轉染SH-SY5Y細胞后，向培養(yǎng)液中加入百草枯，western印跡檢測細胞裂解液中活化的caspase3、失活的PARP和p-IκB的水平。
　　2、ANKIB1與CaM的關系
　　首先用pull down和Co-IP證明ANKIB1與CaM相互作用，然后調整反應體系中游離的Ca2+濃度，研究Ca2+對二者相互作用的影響。
　　將pFLAG-CMV-CaM和pCMV-

4、Myc-ANKIB1共轉染HEK293T細胞，48 h后對qPCR和western印跡分析CaM對ANKIB1基因表達的影響。蛋白質穩(wěn)定性實驗研究CaM對ANKIB1蛋白穩(wěn)定性的影響。
　　3、雙熒光素酶報告基因分析ANKIB1對NFAT轉錄因子活性的影響
　　將pCMV-Myc-ANKIB1轉染HEK293T細胞，24 h后向培養(yǎng)液中加入離子霉素(2μM)或者環(huán)孢菌素A（2μM）處理6h，然后雙熒光素酶報告基因分析ANKI

5、B1對NFAT轉錄因子活性的影響。
　　4、CnAα4功能鑒定
　　Pull down檢測CnAα4與CaM的結合能力，免疫熒光分析CnAα4對NFAT核轉位的影響，雙熒光素酶報告基因分析CnAα4對NFAT轉錄因子活性的影響。
　　結果：
　　1、轉染pCMV-Myc-ANKIB1的SH-SY5Y細胞經(jīng)百草枯處理之后活化的caspase3和失活的PARP水平較對照組均有所降低;
　　2、ANKIB1與Ca

6、M相互作用，不同濃度的Ca2+CaM-agarose上結合的ANKIB1的量有差別，CaM通過增強ANKIB1的蛋白質穩(wěn)定性來調節(jié)ANKIB1基因的表達;
　　3、ANKIB1能夠抑制NFAT的轉錄因子活性;
　　4、CnAα4具有與CnAα1相似的CaM親和力，能夠促進NFATc1的核轉位，較CnAα1有更強的激活NFAT轉錄因子活性的能力。
　　結論：
　　1、ANKIB1與CaM相互作用，抑制NFAT的轉錄