TMEFF2基因?qū)H-SY5Y細(xì)胞的生長抑制作用.pdf

1、目的:(1)克隆全長的TMEFF2基因,構(gòu)建真核基因表達(dá)載體;(2)構(gòu)建TMEFF2基因RNA干擾載體;(3)對蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位;(4)篩選并建立穩(wěn)定的基因過表達(dá)與低表達(dá)細(xì)胞株,通過檢測這兩種細(xì)胞株生長特性的變化,初步推斷蛋白的功能。
　　 方法:實驗分為兩個部分:(1)將克隆好的全長TMEFF2基因連接入pEGFP-N2載體,以脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,在細(xì)胞中可表達(dá)生成TMEFF-EGFP融合蛋白,經(jīng)G41

2、8篩選建立TMEFF2過表達(dá)細(xì)胞株,同時篩選出作為對照的pEGFP-N2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。以MTT法測定TMEFF2過表達(dá)細(xì)胞株和pEGFP-N2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以及SH-SY5Y細(xì)胞的增殖性。同時用激光共聚焦顯微鏡對TMEFF2基因所表達(dá)的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。(2)設(shè)計并構(gòu)建2種針對TMEFF2的RNA干擾載體,轉(zhuǎn)染入SH-SY5Y細(xì)胞,經(jīng)G418篩選建立TMEFF2低表達(dá)細(xì)胞株,同時篩選出作為對照的pSuper-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

3、通過實時熒光定量PCR檢測出干擾效果較好的低表達(dá)細(xì)胞株,再以MTT法測定該細(xì)胞株和pSuper-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以及SH-SY5Y細(xì)胞的增埴性。
　　 結(jié)果:(1)成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-TMEFF2,pEGFP-RNAi1和pEGF-RNAi2。(2)實時熒光定量PCR檢測得到pEGFP-RNAi1的干擾效果較好:(3)TMEFF2-EGFP融合蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜;(4)篩選并建立了穩(wěn)定的基因過表達(dá)與低表達(dá)細(xì)胞株;