APP695-siRNA慢病毒載體構(gòu)建及其對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中APP695基因表達(dá)的作用.pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)APP695的siRNA慢病毒載體，并檢測(cè)其對(duì)人神經(jīng)纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y中APP695基因表達(dá)作用的研究，可能為阿爾茨海默病的基因治療提供新的途徑。
　　 方法：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)篩選確定的APP695基因寡核苷酸序列特異性siRNA有效靶序列；同時(shí)合成1對(duì)陰性對(duì)照寡核苷酸序列。合成后經(jīng)退火形成雙鏈DNA。將pFU-GW-iRNA質(zhì)粒經(jīng)HpaⅠ、XhoⅠ雙酶切后，將退火形成的雙鏈DNA連接到線性化pFU-G

2、W-iRNA質(zhì)粒，構(gòu)建重組APP695-siRNA表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定。同時(shí)完成陰性對(duì)照重組質(zhì)粒的構(gòu)建。將它們分別和包裝質(zhì)粒混合物共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒，并進(jìn)行滴度測(cè)定。然后感染SH-SY5Y細(xì)胞，分未經(jīng)病毒感染(CON)組、陰性對(duì)照病毒感染(NC)組和慢病毒介導(dǎo)陽(yáng)性干擾(APP695-RNAi)組；感染72h應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(FQ-RT PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞APP

3、695 mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和DNA測(cè)序證實(shí)目的寡核苷酸片段已被準(zhǔn)確克隆到pFU-GW-iRNA質(zhì)粒上。②各質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T后收獲慢病毒顆粒。③各組慢病毒載體感染SH-SY5Y細(xì)胞72h后，APP695-siRNA組APP695 mRNA較CON組、NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而CON組與NC組間無(wú)明顯差異(p=0.112)。