SH-SY5Y細胞α3尼古丁受體表達水平的改變對突觸相關蛋白的影響.pdf

1、目的：
　　研究人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)α3尼古丁受體(?3 nicotinic acetylcholine receptors,α3 nAChR)基因表達上調及下調后對細胞突觸相關蛋白及鈣信號通路相關蛋白的影響，從而探討α3 nAChR在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)發(fā)病機制中的可能作用。
　　方法：
　　(1)采用逆轉錄PCR的方法獲取人α3 nAChR基因，用T4 DNA連接

2、酶將其連接到pcDNA3.1質粒，構建重組質粒α3 nAChR-pcDNA3.1，電泳鑒定插入片段大小，雙向測序鑒定插入堿基序列和方向；下調α3 nAChR水平選擇商品化的α3 nAChR shRNA Plasmid。(2)瞬時轉染后，用Real-time PCR(qPCR)法和蛋白免疫印跡(Western Blot)法鑒定得到α3 nAChR基因上調及下調的SH-SY5Y細胞。(3)用qPCR和WB方法分別檢測SH-SY5Y細胞中突觸

3、素(synaptophysin，SYP)、突觸后膜蛋白(PSD-95)、銜接蛋白180(adaptor protein，AP180)、發(fā)動蛋白1(dynamin1，DYN1)、鈣調蛋白(Calmodulin，CaM)、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(Calmodulin-binding protein kinase I I，CaMKI I)環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP responsive element-binding protei

4、n，CREB) mRNA和蛋白及磷酸化CREB(pCREB)蛋白表達水平的變化。
　　結果：
　　(1)成功構建了使?3 nAChR上調的重組質粒?3 nAChR-pcDNA3.1。(2)將?3 nAChR-pcDNA3.1質粒轉到 SH-SY5Y細胞中后，與空載質粒組及正常對照組相比，α3 nAChR mRNA及蛋白表達水平分別增加了418%和116%(P<0.01)；將α3 nAChR shRNA Plasmid質粒轉染

5、到 SH-SY5Y細胞中后，與空載質粒組及正常對照組相比，α3 nAChR mRNA及蛋白表達水平分別降低了76%和67%(P<0.01)。(3)α3 nAChR上調組的突觸相關蛋白SYP、PSD-95、AP180、DYN1、CaM、CaMKI I、CREB mRNA和蛋白及pCREB蛋白表達水平與對照組相比都有增加，而α3 nAChR下調組的突觸相關蛋白SYP、PSD-95、DYN1、AP180、CaM、CaMKI I、CREB mR

6、NA和蛋白及 pCREB蛋白表達水平與對照組相比都有降低(P<0.01，P<0.05)。
　　結論：
　　SH-SY5Y細胞α3 nAChR水平上調能夠提高突觸相關蛋白SYP、PSD-95、AP180、DYN1及鈣信號通路相關蛋白CaM、CaMKI I、CREB mRNA和蛋白以及pCREB蛋白的表達水平，而SH-SY5Y細胞α3 nAChR水平下調能夠降低突觸相關蛋白SYP、PSD-95、AP180、DYN1及鈣信號通路相