神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位沉默對SH-SY5Y細胞β淀粉樣蛋白和凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、貴陽醫(yī)學院2011屆碩士研究生論文1神經(jīng)型尼古丁受體神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位亞單位沉默對沉默對SHSY5Y細胞細胞β淀粉樣蛋白和淀粉樣蛋白和凋亡的影響及其機制研究凋亡的影響及其機制研究生物化學與分子生物學研究生：張雪玲導師：官志忠教授單可人教授摘要【目的】測定神經(jīng)型尼古丁受體(NeuronalnicotinicacetylcholinereceptnAChR)α3亞單位mRNA沉默后的神經(jīng)母細胞瘤細胞(Neuroblastomacel

2、lSHSY5Y)中β淀粉樣蛋白（?Amyloidpeptide，Aβ）含量、β分泌酶兩個亞型（Bace1和Bace2)mRNA和蛋白表達水平、細胞凋亡水平、凋亡相關(guān)通路P38MAPK及凋亡相關(guān)分子（Bax、Bcl2）含量，研究α3nAChR亞單位在阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）發(fā)病中的神經(jīng)保護作用?！痉椒ā窟x用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3nAChRsiRNA表達質(zhì)粒的SHSY5Y細胞、空質(zhì)粒對照細胞和正常對照組細胞，用實時熒

3、光定量PCR(RealtimePCR)和蛋白質(zhì)印跡方法（WesternBlotting）檢測α3nAChR亞單位mRNA和蛋白表達水平；用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Aβ含量；用RealtimePCR和WesternBlotting方法檢測細胞中β分泌酶兩個亞型（Bace1和Bace2）mRNA和蛋白表達水平。用Aβ（10μmolL，48小時）處理α3nAChR亞單位mRNA沉默后的SHSY5Y細胞、空質(zhì)粒對照細胞和正

4、常對照組細胞，用AnnexinV–FITC凋亡檢測試劑盒，經(jīng)流式細胞儀測定細胞凋亡水平；用WesternBlotting方法測定P38MAPK通路中P38蛋白表達水平；用ELISA方法檢測Bax、Bcl2含量?！窘Y(jié)果】與空質(zhì)粒對照組及正常對照組細胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3nAChRsiRNA表達質(zhì)粒的SHSY5Y細胞中，α3nAChR亞單位mRNA及蛋白表達水平降低，A?含量增加，Bace1mRNA和蛋白表達水平增加，Bace2mRNA和蛋白

5、表達水平減少。用Aβ處理后，與空質(zhì)粒對照組及正常對照組細胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3nAChRsiRNA表達質(zhì)粒的SHSY5Y細胞中，細胞凋亡率增加，磷酸化P38蛋白表達量增加，而總P38蛋白表達水平未見明顯改變，Bax含量增加、Bcl2含量減少?！窘Y(jié)論】針對α3nAChR亞單位的小分子干擾RNA有效地抑制了培養(yǎng)細胞中α3nAChR亞單位mRNA和蛋白水平的表達；α3nAChR亞單位mRNA沉默可以增加貴陽醫(yī)學院2011屆碩士研究生論文3前言阿

6、爾茨海默氏病(Alzheimer’sdisease，簡稱AD，又稱老年性癡呆)，是一種主要在老年期發(fā)生的以智力緩慢性進行性喪失為主要特征的神經(jīng)退變性疾病。AD已成為繼心臟病、癌癥、中風后的第四位死亡原因。其主要臨床表現(xiàn)為進行性認知功能障礙、記憶力衰退、性格和行為改變等。在歐美發(fā)達國家及我國，AD發(fā)病有增多的趨勢。一般年齡在65歲左右時，AD的發(fā)病率約為25%年齡75歲左右時，發(fā)病率約為10%，年齡到90歲時，AD發(fā)病率可高達3540%[

7、12]。病理學上以細胞外老年斑(SenileplaquesSPs)形成及神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NeurofibrillarytanglesNFTs)及神經(jīng)元丟失為主要特征[35]。老年斑的主要成分為?淀粉樣蛋白(?Amyloidpeptide，A?)，是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以引起神經(jīng)元的損傷和調(diào)亡，在AD的發(fā)病中起著重要的作用。A?是APP經(jīng)?及?分泌酶水解生成的3943個氨基酸多肽，其中的2535氨基酸殘基是神經(jīng)毒性必需結(jié)構(gòu)。β分

8、泌酶（BACE）是啟動Aβ形成的關(guān)鍵限速酶。因此，BACE有望成為治療AD的作用靶點，為開發(fā)治療AD提供了一條新思路[6]。在AD的發(fā)病機制中膽堿能受體的改變引起了越來越多的重視，膽堿能受體包括尼古丁受體和毒蕈堿樣受體，尼古丁受體又分為神經(jīng)型和肌肉型。nAChR與大腦學習記憶、智力發(fā)育和識別能力等腦功能有關(guān)，還具有明顯的神經(jīng)保護作用[7]，在阿爾茨海默病的發(fā)病中起著重要的作用。本課題組前期研究表明α3nAChR亞單位具有一定的神經(jīng)保護作

9、用，在AD的發(fā)病機制中具有重要作用[8]，但其具體機制我們并不清楚，其是否與β淀粉樣蛋白生成，及與其密切相關(guān)的β分泌酶有關(guān)，有待本實驗進一步研究。本研究將細胞分為正常對照組(細胞未經(jīng)任何處理，無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NegativecontrolpSilencer3.1H1neo的空質(zhì)粒對照組，轉(zhuǎn)染α3nAChRpSilencer3.1H1neo質(zhì)粒的實驗組，觀察α3nAChR亞單位對Aβ含量的影響及對β分泌酶兩個亞型（Bace1Bac