TFPI-2參與SH-SY5Y細胞化學缺氧調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：缺氧損傷見于多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦梗死、腦出血、腦腫瘤、高原腦水腫等等。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可以引起腦部一系列功能蛋白和基因表達的變化，如腦紅蛋白等等。其中缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是目前已知的介導缺氧過程最重要的核轉錄因子，可以調(diào)控上百種基因的表達。HIF調(diào)控的缺氧通路廣泛參與能量代謝、細胞周期調(diào)節(jié)、血管生成、細胞凋亡和腫瘤侵襲等病理過程，是缺氧過程中重要的調(diào)控因子。到目前為止，腦缺氧

2、損傷的機制和調(diào)控通路并不完善，探索腦缺氧損傷新的調(diào)控因子，進一步完善缺氧通路，可以為我們提供神經(jīng)保護的新靶點，對于腦部缺氧性疾病的預防和治療具有重要意義。
　　為尋求新的缺氧相關標志性因子，本課題組利用基因芯片及 miRNA芯片等技術對低壓缺氧大鼠腦皮質(zhì)進行差異因子的檢測，發(fā)現(xiàn)了 TFPI-2和miR-92a-2這兩個具有靶向關系的差異表達因子，其中 TFPI-2表達與缺氧呈正相關，miR-92a-2則相反。組織因子途徑抑制物-2

3、（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）是一種天然的抗凝因子，是內(nèi)源性TF抑制物，屬Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制家族。TFPI-2是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以抑制包括纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等在內(nèi)多種蛋白酶的活性，維持細胞外基質(zhì)的完整性。研究發(fā)現(xiàn)，TFPI-2參與多種惡性腫瘤的轉移和侵襲過程，與腫瘤組織血管生成、細胞凋亡等過程密切相關。但是TFPI-2在缺氧過程中的變化及調(diào)控機制沒有得到

4、充分研究，TFPI-2是否通過HIF經(jīng)典途徑參與細胞缺氧損傷也并不清楚。
　　氯化鈷是常用的細胞化學缺氧誘導劑，可抑制HIF-1α降解，激活HIF缺氧通路，模擬細胞缺氧環(huán)境。本實驗擬通過建立SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞氯化鈷化學缺氧細胞損傷模型，探究TFPI-2在SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞缺氧損傷中的變化及可能的調(diào)控機制。
　　方法:
　　1 CoCl2缺氧對SH-SY5Y細胞活性和形態(tài)的影響
　　1.

5、1培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，加入不同濃度CoCl2（0、100、200、400μmol/L）處理細胞，分別在6小時和24小時通過倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，對細胞進行HE染色，觀察細胞化學缺氧前后形態(tài)變化。
　　1.2使用不同濃度CoCl2（0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μmol/L）處理SH-SY5Y細胞，利用MTT法檢測細胞活性變化。1.3用100μmol/L CoCl2處理SH

6、-SY5Y細胞，MTT法檢測缺氧不同時間（0、6、12、24、48、72小時）細胞活性變化。
　　2 CoCl2缺氧前后SH-SY5Y細胞TFPI-2、miR-92a表達水平檢測
　　2.1利用Western blot技術，檢測100μmol/L CoCl2缺氧不同時間（1、2、4、6、8小時）SH-SY5Y細胞HIF-1α和TFPI-2、VEGF表達水平，對氯化鈷化學缺氧后基因表達變化趨勢進行分析。
　　2.2 Re

7、al-time PCR法檢測100μmol/L CoCl2缺氧8h后HIF-1α mRNA、TFPI-2 mRNA和VEGF mRNA表達變化。
　　2.3 Real-time PCR法檢測100μmol/L CoCl2缺氧8h后miR-92a表達變化。
　　3 YC-1預處理對SH-SY5Y細胞缺氧后TFPI-2表達的影響
　　3.1用10μmol/L、100μmol/L YC-1預處理細胞2小時，對照組加入相同濃度

8、的DMSO培養(yǎng)2小時，然后加入100μmol/L CoCl2共培養(yǎng)細胞8h， EdU法檢測各組細胞增殖活性變化。
　　3.2 Western blot檢測缺氧后YC-1預處理對缺氧后細胞TFPI-2、HIF-1α、VEGF蛋白表達水平的影響。
　　結果：
　　1 CoCl2缺氧對細胞形態(tài)產(chǎn)生影響并降低細胞存活率
　　CoCl2缺氧后 SH-SY5Y細胞胞體變小，突觸變細變短，核仁膨脹，隨著氯化鈷濃度缺氧時間延長，

9、細胞逐漸出現(xiàn)皺縮凋亡。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，CoCl2缺氧處理會顯著降低細胞活性（P<0.05），細胞存活率下降呈劑量和時間依賴性。
　　2 CoCl2缺氧可以降低細胞內(nèi)miR-92a含量，上調(diào)TFPI-2 mRNA和蛋白表達水平
　　Western blot結果顯示，CoCl2缺氧處理后2小時細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達水平開始升高，在6-8小時趨于穩(wěn)定。CoCl2處理可以有效激活HIF缺氧通路，建立細胞缺氧模型。缺

10、氧4小時后TFPI-2蛋白表達水平開始升高（P<0.05），隨著缺氧時間延長，細胞內(nèi)TFPI-2表達水平逐漸升高而后穩(wěn)定表達，與HIF-1α變化趨勢相似。Real-time PCR結果顯示，與對照組相比，缺氧組細胞 TFPI-2、VEGF mRNA表達顯著上升，而缺氧組細胞miR-92a表達水平較對照組明顯降低（P<0.05）。
　　3 YC-1預處理可減弱CoCl2缺氧對細胞增殖活性的抑制，降低缺氧后SH-SY5Y細胞內(nèi)TFPI

11、-2表達水平。
　　EdU檢測顯示，缺氧后，SH-SY5Y細胞增殖活性降低，而 YC-1預處理可減弱缺氧對細胞增殖的抑制作用（P<0.05）。Western blot結果顯示，與缺氧組相比，YC-1預處理可以抑制缺氧后細胞 HIF-1α水平，在YC-1預處理組VEGF、TFPI-2蛋白表達水平較缺氧組降低，呈劑量依賴性（P<0.05）。
　　結論：
　　本實驗成功建立 SH-SY5Y細胞氯化鈷化學缺氧模型，證實 TFP