2，3-吲哚醌抗人神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y作用及機制研究.pdf

1、背景與目的：2，3-吲哚醌（2，3-dioxoindoline，isatin，ISA，以下簡稱吲哚醌）是存在于哺乳動物體液及組織中的一種天然物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，是我國獨創(chuàng)I類天然抗癌新藥靛玉紅的單體結(jié)構(gòu)。前期工作已顯示ISA對腫瘤細(xì)胞有抑制增殖的作用，但具體作用機制尚不明確。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y為靶細(xì)胞，采用體外培養(yǎng)細(xì)胞（體外實驗）及建立裸鼠模型（體內(nèi)實驗）方法從分子水平、細(xì)胞水平及動物整體水平探討ISA的抗腫瘤活性

2、及其作用機制，為最終將該藥開發(fā)成一種新型的具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的天然抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。 方法：1.體外實驗：體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，采用MTT比色法、熒光染色、瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)(flo.cytometry.FCM)、RT-PCR、Wester.blot等方法，觀察不同濃度ISA對SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響。2.體內(nèi)實驗：培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞接種裸鼠建立荷瘤裸鼠模型，觀察ISA對荷瘤裸鼠移植瘤

3、生長的抑制情況，檢測ISA處理后瘤組織內(nèi)Bcl-2/Bax的表達(dá)及活化caspase-3的表達(dá)，探討ISA體內(nèi)外的抗腫瘤活性及其作用機制。 結(jié)果：1.體外實驗：ISA(0、50、100、20.μmol/L)作用SH-SY5Y細(xì)胞4.h后，在熒光顯微鏡下觀察到20.μmol/.ISA處理組細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞核固縮、有DNA碎片；瓊脂糖凝膠電泳顯示100、20.μmol/.ISA處理組細(xì)胞出現(xiàn)梯形條帶；RT-PCR及

4、Wester.blot結(jié)果顯示，隨ISA濃度的增加，Bcl-.mRNA和蛋白表達(dá)均下降、Ba.mRNA和蛋白表達(dá)無明顯改變，Bcl-2/Bax比值下降；流式細(xì)胞術(shù)及Wester.blot檢測到隨著ISA濃度的增加，線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素c由線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放增加，caspase-3的活化率逐漸增加，明顯高于對照組(P<0.05)；Wester.blot進(jìn)一步檢測到caspase-3的下游底物ICA.(inhibito.o.caspa

5、se-activate.dnase，Caspase激活的脫氧核糖核酸酶抑制劑)被降解。MTT比色結(jié)果顯示ISA能抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期分析表明，經(jīng)50、100、20.μmol/.ISA處理4.h后，G1期SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)明顯增加，呈明顯的G1期阻滯；Wester.blot結(jié)果顯示隨ISA濃度增加，磷酸化的ERK蛋白及細(xì)胞周期因子CyclinD1(CDK1)蛋白表達(dá)逐漸減少(P<0.05)。2.體內(nèi)實驗：結(jié)果顯示ISA能