川芎嗪誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化及機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)元損傷是神經(jīng)系統(tǒng)常見病。此類疾病的預(yù)后與神經(jīng)細(xì)胞的存活、神經(jīng)元分化和功能恢復(fù)密切相關(guān)，亦與相關(guān)基因表達(dá)的激活或抑制有關(guān)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ(TopoisomeraseⅡβ，TopoⅡβ)是促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元分化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的一種活性生物堿，化學(xué)名2，3，5，6-四甲基吡嗪。最近有研究報道了其對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化有促進(jìn)作用，但

2、其確切作用機(jī)制尚不明了。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為神經(jīng)元分化模型，用TMP誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，并檢測細(xì)胞分化過程中TopoⅡβ的表達(dá)變化;進(jìn)而探討TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的分子機(jī)制。為TMP在神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)研究與治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。本研究共分三部分。
　　第一部分 川芎嗪對SH-SY5Y細(xì)胞生長特性的影響和神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)作用
　　目的:研究TMP對SH-SY5Y細(xì)胞生長狀況的影響，以及誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化的作

3、用。
　　方法:1、細(xì)胞培養(yǎng)。2、MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞體外增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線。3、乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)。4、細(xì)胞周期和凋亡率檢測。5、細(xì)胞核DAPI染色。6、Caspase-3活性檢測。7、細(xì)胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測。8、免疫印跡檢測神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白MAP2、tau的表達(dá)和p21蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.隨著TMP濃度的增高和培養(yǎng)時間的延長，其對細(xì)胞增殖的抑制逐漸增加。提示TMP對SH-SY5Y細(xì)胞

4、增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性。
　　2.低濃度TMP(40，80和120μmol/L)對SH-SY5Y細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。
　　3.TMP處理后，Caspase-3活性和active-Caspase-3蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。顯示80μmol/L TMP在誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)元分化中未導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　4.在20μmol/L TMP作用下，SH-SY5Y細(xì)胞突起長度和分化百分率改變不明顯(P＞

5、0.05)。而40μmol/L誘導(dǎo)2天，細(xì)胞突起開始出現(xiàn)明顯增長，與對照細(xì)胞比較有顯著性差異(P＜0.05)。80μmol/L和120μmol/L TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞神經(jīng)突起長度和分化百分率均較對照細(xì)胞明顯增長，且均比40μmol/L誘導(dǎo)后突起長度增加明顯(P＜0.05)。
　　5.采用神經(jīng)元分化標(biāo)志分子，微管相關(guān)蛋白2和tau蛋白鑒定神經(jīng)元分化。SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)80μmol/LTMP誘導(dǎo)0，3和5日后MAP

6、2和tau蛋白表達(dá)增高，與對照組細(xì)胞相比有明顯差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:80μmol/L TMP誘導(dǎo)可使SH-SY5Y細(xì)胞脫離細(xì)胞周期，并向神經(jīng)元分化;且未見明顯的細(xì)胞毒性。因此，本研究選用80μmol/L TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，并繼續(xù)用于后繼機(jī)制研究。
　　第二部分 川芎嗪上調(diào)TopoⅡβ誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制
　　目的:檢測TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化過程中，TopoⅡβ的表達(dá)變化及

7、其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　方法:1、細(xì)胞培養(yǎng)。2、細(xì)胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測。3、Western blot檢測TopoⅡα、TopoⅡβ、組蛋白H3、H4、乙酰化組蛋白H3和乙?；M蛋白H4的表達(dá)。4、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測TopoⅡβmRNA表達(dá)。5、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的募集與結(jié)合。
　　結(jié)果:1.與對照細(xì)胞比較，TMP誘導(dǎo)分化細(xì)胞的TopoⅡα蛋白表達(dá)在第

8、3天和第5天均明顯減少(P＜0.05);而TopoⅡβ蛋白表達(dá)則明顯增加(P＜0.05)。
　　2.與對照細(xì)胞相比，TopoⅡβmRNA的表達(dá)在TMP誘導(dǎo)分化的第3天和第5天均表現(xiàn)為增加(P＜0.05)。
　　3.TopoⅡβ抑制劑ICRF-193作用后，TopoⅡβ和MAP2蛋白表達(dá)受到抑制(P＜0.05);神經(jīng)突起數(shù)量和長度均明顯下降(P＜0.05)。表明TopoⅡβ與神經(jīng)元分化呈正相關(guān)。
　　4.Ac-H3的表達(dá)

9、在TMP誘導(dǎo)分化的第3天和第5天逐漸增加(P＜0.05);而Ac-H4的表達(dá)在TMP誘導(dǎo)分化的第5天明顯增加(P＜0.05)。提示Ac-H3與Ac-H4均可被TMP誘導(dǎo)表達(dá)，而Ac-H3表達(dá)升高相對較早。
　　5.ChIP檢測顯示，TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過程中，隨著誘導(dǎo)分化時間的延長，特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的Ac-H3與Ac-H4逐漸增高(P＜0.05)。Ac-H3在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合早

10、于Ac-H4。提示Ac-H3發(fā)揮作用早于Ac-H4。
　　結(jié)論:TMP誘導(dǎo)神經(jīng)元分化作用與TopoⅡβ表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。TMP促進(jìn)Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的募集而誘導(dǎo)TopoⅡβ高表達(dá)，是促進(jìn)神經(jīng)元分化的重要機(jī)制。
　　第三部分 PI3K/Akt信號通路參與川芎嗪誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)元分化
　　目的:探討TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過程中，PI3K/Akt和ERK1/2信號通路對

11、TopoⅡβ表達(dá)和神經(jīng)元分化的影響及機(jī)制。
　　方法:1、細(xì)胞培養(yǎng)。2、細(xì)胞分化形態(tài)觀察和分化百分率檢測。3、Western blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)。4、RT-PCR檢測TopoⅡα和TopoⅡβmRNA表達(dá)。5、ChIP檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1與NF-YA在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合。
　　結(jié)果:1.TMP對p-Akt、p-ERK1/2、TopoⅡα、TopoⅡβ、Sp1和NF-YA蛋白表達(dá)的影響
　　80μmol/L

12、 TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化0，1，3和5天。TopoⅡα蛋白的表達(dá)逐漸減少，TopoⅡβ蛋白表達(dá)逐漸增多;p-Akt的表達(dá)逐漸升高(P＜0.05)，p-ERK1/2表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);Sp1的表達(dá)逐漸增高(P＜0.05)，而NF-YA蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。
　　2.PI3K/Akt抑制劑LY294002對p-Akt，TopoⅡα、β、Sp1和NF-YA蛋白表達(dá)的影響
　　應(yīng)用LY294002

13、后，80μmol/L TMP誘導(dǎo)細(xì)胞分化5天，TopoⅡα蛋白的表達(dá)減少，且不受LY294002的影響;TopoⅡβ和Sp1蛋白表達(dá)和p-Akt的表達(dá)受到明顯抑制(P＜0.05)。p-ERK1/2和NF-YA蛋白的表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。
　　3.LY294002抑制TMP誘導(dǎo)的神經(jīng)突起的發(fā)生和神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)
　　TMP誘導(dǎo)第5天，應(yīng)用LY294002后，TMP誘導(dǎo)細(xì)胞的突起長度由150.97±6.62μm

14、下降為91.80±7.82μm（P＜0.05），細(xì)胞分化百分率由80.04±3.26％下降為46.20±33.56％（P＜0.05）。而MEK/ERK抑制劑U0126對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞突起長度和分化百分率均未產(chǎn)生明顯作用(P＞0.05)。經(jīng)LY294002處理細(xì)胞后，神經(jīng)元分化標(biāo)志蛋白MAP2的表達(dá)受到明顯抑制(P＜0.05)。而U0126對MAP2蛋白表達(dá)未產(chǎn)生明顯抑制作用。表明PI3K/Akt信號通路參與了TMP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)

15、胞分化。
　　4.LY294002對TMP誘導(dǎo)TopoⅡα和TopoⅡβmRNA表達(dá)的影響
　　TMP可上調(diào)TopoⅡβmRNA的表達(dá)，而抑制TopoⅡαmRNA的表達(dá)。與TMP誘導(dǎo)組相比較，加入PI3K/Akt抑制劑LY294002作用后，TopoⅡβ mRNA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，而TopoⅡαmRNA的表達(dá)無明顯改變(P＞0.05)。分別應(yīng)用蛋白質(zhì)合成抑制劑亞胺環(huán)己酮(Cycloheximide，CHX)和RNA

16、聚合酶Ⅱ抑制劑鵝膏菌素（α-amanitin）預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞后檢測TopoⅡβ mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示:α-amanitin(50μg/mL)可明顯降低TMP誘導(dǎo)的TopoⅡβmRNA的表達(dá)，而CHX(10 mmol/L)則對其表達(dá)無明顯影響。表明TMP上調(diào)TopoⅡβ的表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，并且與PI3K/Akt信號途徑的激活有關(guān)。
　　5.TMP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Sp1和NF-YA在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)結(jié)合
　　

17、ChIP檢測顯示，TMP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過程中，Sp1蛋白特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子GC盒，促進(jìn)了TopoⅡβ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002作用后，結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的Sp1蛋白受到明顯抑制(P＜0.05)。轉(zhuǎn)錄因子NF-Y的亞型NF-YA在神經(jīng)分化后期與TopoⅡβ基因啟動子區(qū)的結(jié)合也呈現(xiàn)增高(P＜0.05)，而LY294002對NF-YA與TopoⅡβ基因啟動子區(qū)