川芎嗪二甲苯基哌嗪對(duì)SH-SY5Y氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分,具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴(kuò)血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用,廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病的臨床治療。近年來研究表明TMP能透過血腦屏障,富集于腦,尤其是腦干,有很強(qiáng)的中樞作用。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成極性和水溶性較大的代謝物而迅速被排出體外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺點(diǎn)。經(jīng)川芎嗪及其衍生物構(gòu)效關(guān)系研究,證實(shí)吡嗪環(huán)為其基本藥效基團(tuán)；2,3,5,6位甲基為藥代基團(tuán)。在保留川芎嗪母

2、核(吡嗪環(huán))基本藥效基團(tuán)不變基礎(chǔ)上,以氟桂利嗪的(4,4’-二氟)二苯甲基-1-哌嗪基甲基基團(tuán)取代川芎嗪的2位甲基,合成出川芎嗪二苯甲基哌嗪(TMPDP)。氟桂利嗪(FLU)是臨床上重要的心腦血管疾病治療藥物,(4,4’-二氟)二苯甲基哌嗪是其重要的活性基團(tuán)。以氟桂利嗪的活性基團(tuán)取代川芎嗪分子的藥代基團(tuán),以期克服川芎嗪體內(nèi)半衰期短、生物利用度低等缺點(diǎn),并通過協(xié)同作用增強(qiáng)藥效,提高抗心腦血管疾病作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用過氧化氫作為

3、外源性自由基生成系統(tǒng),模擬神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷,建立離體培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞(SH-SY5Y)氧化應(yīng)激損傷模型,觀察TMPDP對(duì)氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制,為其用于腦血管疾病治療提供進(jìn)一步的資料,同時(shí)也為傳統(tǒng)中藥的開發(fā)提供新思路。
　　 1.TMPDP對(duì)正常SH-SY5Y細(xì)胞存活力的影響
　　 采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,觀察化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種100pl計(jì)3000個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞

4、,培養(yǎng)24h后,向培養(yǎng)孔中分別加入TMPDP與細(xì)胞共孵育,TMPDP溶液終濃度分別為5,10,20,40,80μmol·L-1。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12h后,每孔加入MTT溶液(5mg·ml-1)10μl,37℃孵育4h,終止培養(yǎng),小心吸棄培養(yǎng)板中的液體,每孔加入100μl DMSO,振蕩1min,使結(jié)晶物充分溶解。置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)570nm處吸光度值(OD570)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同濃度TMPDP作用12h后,低濃度時(shí)對(duì)細(xì)

5、胞生存率無明顯影響,與正常組相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。80μmol/L有降低細(xì)胞生存率的趨勢(shì),與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 2.TMPDP對(duì)氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活力的影響
　　 細(xì)胞與不同濃度化合物(5,10,20,40,80μmol·L-1TMPDP)孵育的同時(shí),暴露于200μmol/L,的H2O2溶液中。采用等濃度的氟桂利嗪(FLU)作為對(duì)照,采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SH-S

6、Y5Y細(xì)胞氧化損傷后,細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01),而TMPDP5、10、20、40μmol/L組細(xì)胞損傷抑制率明顯高于相對(duì)應(yīng)的5、10、20、40μmol/L FLU組,但80μmol/LTMPDP組則明顯低于FLU80μmol/L組。故以下實(shí)驗(yàn)均采用5、10、20μmol/L三個(gè)濃度的TMPDP和10μmol/L FLU。
　　 3.TMPDP對(duì)H2O2氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率的影響
　　 收集氧化

7、損傷處理后的各組SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液,參照試劑盒說明分別測(cè)定培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中的LDH活性,計(jì)算細(xì)胞LDH釋放率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后,細(xì)胞活力降低,細(xì)胞膜通透性增加,胞內(nèi)LDH漏出增多,培養(yǎng)液中LDH水平顯著升高(P<0.01)。而5、10、20μmol·L-1的川芎嗪二苯甲基哌嗪處理后的細(xì)胞,細(xì)胞活力升高,LDH釋放率明顯減低(P<0.01),提示TMPDP對(duì)氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞膜

8、的完整性具有保護(hù)作用。
　　 4.TMPDP體外抗氧化能力的檢測(cè)
　　 采用DPPH*法檢測(cè)TMPDP體外抗氧化能力。DPPH*是一種穩(wěn)定的自由基。加入不同濃度的抗氧化劑后,在516nm處的紫外吸光度會(huì)發(fā)生改變,用以檢測(cè)化合物清除自由基的能力。我們選擇了維生素E和TMP作為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)120μmol/mLTMPDP對(duì)自由基的清除率為40％左右,提示TMPDP有中等程度的抗氧化能力。但其體外抗氧化能力不如維生素E,優(yōu)于120

9、μmol/mL TMP。
　　 5.TMPDP對(duì)H2O2氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活力和GSH含量的影響
　　 收集氧化損傷處理后的各組SH-SY5Y細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液。參照SOD、GSH檢測(cè)試劑盒說明分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH含量、SOD活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后,培養(yǎng)液中SOD活力和GSH含量顯著降低(P<0.01),MDA含量顯著增加(P<0.01)。10、20μmol·

10、L-1的川芎嗪二苯甲基哌嗪處理后的細(xì)胞,SOD活力顯著升高(P<0.01),GSH含量顯著增加(P<0.01),MDA生成量明顯減少。TMPDP對(duì)H2O2所致SH-SY5Y細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。另外,等劑量(10μmol/L)的TMPDP對(duì)三個(gè)指標(biāo)的作用明顯優(yōu)于FLU,具有顯著差異,說明TMPDP有更強(qiáng)的抗氧化損傷作用。
　　 6.TMPDP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響
　　

11、6.1 TMPDP對(duì)細(xì)胞凋亡數(shù)目和形態(tài)的影響
　　 將SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24小時(shí)后,經(jīng)H2O2損傷同時(shí)加入TMPDP10μmol·L-1孵育12h。用Hoechst33258染色后,通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。觀察結(jié)果顯示,Hoechst33258染色后,凋亡細(xì)胞核著色增強(qiáng),染色體固縮并向核膜靠攏,DNA斷裂成塊狀以及形成凋亡小體。而正常細(xì)胞的核(染色)質(zhì)DNA疏松均勻,熒光染色后細(xì)胞核著色淺

12、而均一。比較正常對(duì)照組、過氧化氫損傷組、TMPDP給藥組(10μmol/L)SH-SY5Y細(xì)胞染色后細(xì)胞染色質(zhì)形態(tài)的變化,發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞易凋亡。細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài),細(xì)胞核固縮并向核膜靠攏,染色質(zhì)斷裂、聚集,DNA斷裂成塊狀,細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)可見致密的顆粒狀強(qiáng)熒光,嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞出泡形成凋亡小體。而TMPDP處理組細(xì)胞呈彌漫性均勻熒光,且熒光較弱,細(xì)胞核形態(tài)趨于正常,凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少。提示H2O2氧化損傷后能明顯誘導(dǎo)SH-SY5

13、Y細(xì)胞發(fā)生凋亡,而TMPDP可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 6.2 TMPDP對(duì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活力的影響
　　 Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族,是細(xì)胞凋亡過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶,是凋亡的最后執(zhí)行者。Caspase-3蛋白活性的高低在細(xì)胞凋亡中具有顯著意義。H2O2損傷后細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性顯著增強(qiáng),加入T

14、MPDP的實(shí)驗(yàn)組其Caspase3活性明顯降低,與氧化損傷組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明TMPDP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。
　　 7.TMPDP對(duì)H2O2氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
　　 Ca2+參與細(xì)胞代謝的生理、病理過程,試驗(yàn)表明:腦缺血后出現(xiàn)的一系列病理生化改變,如ATP匱乏、膜去極化、離子泵衰竭、游離脂肪酸中毒等,都與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高有關(guān)。細(xì)胞

15、內(nèi)Ca2+超載可能是腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)中的化合物是在TMP的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上修飾得到的,因TMP具有鈣離子拮抗作用,故觀察TMPDP是否也具有鈣拮抗作用,以期解釋該化合物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):過氧化氫損傷后,SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度由正常組的159.0nmol/L升高至966.0nmol/L。給予5、10、20μmol/L TMPDP后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別降低至414.0nmol/L(P<0.01)、312.

16、0nmol/L(P<0.01)和299.0nmol/L(P<0.01),呈現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系。FLU也呈現(xiàn)明顯的鈣拮抗作用,但等濃度的TMPDP的鈣拮抗作用明顯高于FLU。
　　 8.TMPDP對(duì)H2O2氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)NO含量和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)活力的影響
　　 NO對(duì)細(xì)胞凋亡具有雙重調(diào)節(jié)作用。這種雙重調(diào)節(jié)主要取決于NO的來源和生理濃度。NO的生物合成是在NO合成酶(NOS)的作用下,催化L-精氨

17、酸而產(chǎn)生的。在腦缺血損傷、神經(jīng)損傷過程中,誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)來源的NO生成增多,NO可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)毒作用。故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了NO含量和iNOS的活性,從而觀察化合物TMPDP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷后細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響,分析化合物神經(jīng)保護(hù)作用與NO的關(guān)系。
　　 NO含量的檢測(cè)結(jié)果表明:與正常組比較,H2O2氧化損傷組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)NO含量顯著升高(P<0.01)。與H2O2損傷組比較,20μmol/L TMPDP

18、可顯著降低損傷細(xì)胞內(nèi)NO含量(P<0.01)；10μmol/L FLU也可顯著降低損傷細(xì)胞內(nèi)NO含量(P<0.01)。iNOS活力的檢測(cè)結(jié)果表明:與正常組比較,H2O2損傷組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)iNOS活力顯著升高(P<0.01)。與損傷組比較,5、10和20μmol/L TMPDP可明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)iNOS活性(P<0.05)；10μmol/L FLU也可顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)iNOS活性(P<0.01)
　　

19、 通過H2O2氧化損傷體外培養(yǎng)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞,觀察了TMPDP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果提示:TMPDP在體外有中等程度的抗氧化作用；在細(xì)胞內(nèi),對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有較強(qiáng)的保護(hù)作用,能明顯提高損傷后細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH水平,降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生產(chǎn),并減少細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放,保護(hù)細(xì)胞膜的完整性；能夠減少損傷細(xì)胞內(nèi)DNA片段的產(chǎn)生,減少氧化損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡數(shù)目,并顯著降低凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的活力；具有較強(qiáng)的鈣拮抗作