川芎嗪烴基哌嗪衍生物CXC137對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷及血管性癡呆模型大鼠保護(hù)作用研究.pdf

1、血管性癡呆是發(fā)生在腦血管基礎(chǔ)上的以記憶、認(rèn)知功能缺損為主，或伴有語言、視空間技能及情感或人格障礙的獲得性智能持續(xù)性損害的綜合征。血管性癡呆產(chǎn)生原因多為腦梗塞導(dǎo)致腦缺血，再灌注引起的腦實質(zhì)損傷。當(dāng)今研究表明：興奮性氨基酸毒性、自由基損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡是缺血.再灌注導(dǎo)致的腦實質(zhì)損傷進(jìn)而引起血管性癡呆的主要分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分之一，具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴(kuò)血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用，廣

2、泛應(yīng)用于臨床治療。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化，生成極性和水溶性較大的代謝物而迅速被排出體外，所以川芎嗪存在半衰期短，生物利用度低等缺點。本課題選用的化合物CXC137，是以氟桂利嗪的主要藥效基團(tuán)二苯甲基-1-哌嗪基甲基基團(tuán)取代川芎嗪的藥代基團(tuán)2位甲基而合成出的新型川芎嗪烴基哌嗪類衍生物。氟桂利嗪為第2代哌嗪類鈣拮抗藥，能通過血腦屏障，選擇性擴(kuò)張血管，預(yù)防缺血、缺氧引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載所致細(xì)胞損害，臨床上廣泛用于心腦血管疾病和外周血

3、管功能不全的防治。以氟桂利嗪的活性基團(tuán)取代川芎嗪分子的藥代基團(tuán)，以期克服川芎嗪體內(nèi)半衰期短、生物利用度低等缺點，并通過協(xié)同作用增強藥效，提高抗心腦血管疾病作用。
　　 本研究第一部分以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)作用于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)，模擬體內(nèi)興奮性氨基酸毒性造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷，第二部分采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎并降壓的方法制作大鼠血管性癡呆模型。實驗?zāi)康臑閺牟煌矫嫣接慍XC137對NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損

4、傷和抗凋亡的作用機(jī)制，以及對血管性癡呆模型大鼠的藥理學(xué)作用，為進(jìn)一步開發(fā)該化合物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論基礎(chǔ)。同時，以傳統(tǒng)中藥的有效成分為先導(dǎo)化合物，在構(gòu)效關(guān)系研究的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化，為充分利用我國豐富的天然植物資源進(jìn)行創(chuàng)新藥物研究提供依據(jù)。
　　 1.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響
　　 采用MTT法檢測細(xì)胞活力。實驗結(jié)果顯示：SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)NMDA200μmol/L損傷后，細(xì)

5、胞活力明顯降低(P<0.01)。而溶媒組(3％oDMSO)對細(xì)胞活力無影響。同時發(fā)現(xiàn)，NMDA損傷前或損傷后給予CXC137均對細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用(P<0.01)。
　　 2.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率的影響
　　 收集氧化損傷處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液，參照試劑盒說明分別測定培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中的LDH活性，計算細(xì)胞LDH釋放率。實驗結(jié)果表明：NMDA損傷后SH-SY5Y細(xì)胞

6、LDH釋放率顯著增高(P　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率
　　 細(xì)胞經(jīng)處理后，以Annexin V-FITC/PI雙染后上流式細(xì)胞儀檢測。實驗結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，CXC137各濃度組細(xì)胞的凋亡率明顯降低，且呈劑量依賴性關(guān)系，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

7、>　　 4.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白活性及表達(dá)的影響
　　 使用Caspase-3活力檢測試劑盒和Western Blot檢測Caspase-3活力和表達(dá)。實驗結(jié)果表明：加入NMDA后，Caspase-3蛋白活性及表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，CXC13720、40和80μmol/L三個劑量組均可顯著降低Caspase-3活力和蛋白表達(dá)水平(P　

8、　 5.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響
　　 細(xì)胞懸液以熒光探針Fura-3/AM負(fù)載后，置多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強度，檢測波長為λem=490 nm/λex=526nm。實驗結(jié)果表明：加入NMDA損傷后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高(P<0.01)。給予20、40、80μmol/L CXC137后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著降低(P<0.01)。
　　 6.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞

9、ATP含量的影響
　　 收集細(xì)胞裂解液，用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量。按ATP含量檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞ATP含量。實驗結(jié)果表明：加入NMDA后，細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯降低(P<0.01)。給予20、40、80μmol/L CXC137后，ATP含量顯著升高(P<0.01)。
　　 7.DPPH*法測定CXC137體外清除自由基能力
　　 將不同濃度的抗氧化劑加入DPPH*后，在516nm處的紫外吸光度會發(fā)生改

10、變，用以檢測化合物清除自由基的能力。實驗結(jié)果表明：50mg/ml CXC137體外自由基清除率在40％左右，具有一定的清除自由基的能力。但清除能力不如維生素E和TMP。
　　 8.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞MDA、GSH含量，SOD活力的影響
　　 收集細(xì)胞裂解液，用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量，按MDA、GSH、SOD檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量、SOD活力。實驗結(jié)果表明：加入NMDA

11、后，細(xì)胞內(nèi)MDA生成量顯著增高(P<0.01)。與NMDA組相比，40、80μmol/L CXC137組細(xì)胞內(nèi)MDA生成量均明顯減少（P<0.01）。加入NMDA后，細(xì)胞內(nèi)SOD活力和GSH含量均顯著降低（P<0.01）。與NMDA組相比,40、80μmol/L CXC137組細(xì)胞SOD活力和GSH含量均明顯升高(P<0.01)。
　　 9.CXC137對NMDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)NO含量和NOS活性的影響
　　

12、收集細(xì)胞裂解液，用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量，按NO、NOS檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)NO含量和NOS活性。實驗結(jié)果表明：SH-SY5Y細(xì)胞的NO含量，在NMDA損傷后開始升高，在加入NMDA后24h達(dá)到最高峰，隨后含量開始下降，加入80μmol/L CXC137和氟桂利嗪后，SH-SY5Y細(xì)胞的NO含量均有所下降。SH-SY5Y細(xì)胞的tNOS和iNOS的含量，在NMDA損傷后開始升高，在加入NMDA后12h達(dá)到最高峰，隨后含量開始下

13、降，在36-48h時降至正常水平；加入80μmol/L CXC137和氟桂利嗪后，SH-SY5Y細(xì)胞的tNOS和iNOS含量均有所下降。
　　 10.CXC137對血管性癡呆模型大鼠行動能力的影響
　　 前肢抓握實驗是動物實驗中常用的檢查動物行動能力的實驗方法，方法簡便、快捷。手術(shù)后第30日經(jīng)行前肢抓握實驗用以檢測實驗大鼠行動能力，并進(jìn)行評分結(jié)果表明：反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈后，動物的行動能力有所降低，給予CXC137治療后

14、，動物行動能力有所提高。
　　 11.CXC137對血管性癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　 本實驗采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力，包括定位航行實驗和空間探索實驗兩項檢測指標(biāo)。在定位航行實驗中，模型組大鼠測試成績最差，逃避潛伏期比假手術(shù)組明顯延長(p<0.01)；另外空間探索實驗中，穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限停留時間均顯著減少(p<0.01)，表明雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎造成大鼠腦慢性缺血，4周后模型大鼠已

15、出現(xiàn)顯著的學(xué)習(xí)記憶能力損害，而給予80mg/kgCXC137后，大鼠定位航行實驗逃避潛伏期有所降低，空間探索實驗中，穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限停留時間均顯著增高(p<0.01)。
　　 12.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)谷氨酸含量的影響
　　 收集實驗大鼠腦組織勻漿，用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量，按谷氨酸含量檢測試劑盒說明書測定組織谷氨酸含量。實驗結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎并降壓后，大鼠腦組織勻漿中谷氨酸

16、含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，20、80mg/kg CXC137能夠降低腦組織中谷氨酸含量(p<0.05)。
　　 13.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)MDA、GSH含量和SOD活性的影響
　　 收集實驗大鼠腦組織勻漿，用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量，按MDA、GSH含量檢測試劑盒說明書測定組織MDA、GSH含量，按SOD活性檢測試劑盒說明書測定組織SOD活性。實驗結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎并降壓

17、后，大鼠腦組織勻漿中MDA含量明顯升高(P　　 14.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)NO含量及NOS活性的影響
　　 收集實驗大鼠腦組織勻漿，用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量，按NO含量

18、檢測試劑盒說明書測定組織NO含量，按NOS活性檢測試劑盒說明書測定組織NOS活性。實驗結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎并降壓4周后，大鼠腦組織勻漿中NO含量和NOS活性無顯著變化（無統(tǒng)計學(xué)差異）。
　　 15.CXC137對血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)線粒體的影響
　　 線粒體懸液的渾濁度可反映線粒體腫脹度，其吸光度越高說明線粒體腫脹程度越高，線粒體損傷越嚴(yán)重。實驗結(jié)果表明：雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎并降壓4周后，大鼠腦內(nèi)線粒體腫脹度