外源線粒體抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、帕金森氏病是一種常見的中老年神經(jīng)退行性疾病，常引起運(yùn)動(dòng)障礙，如動(dòng)作遲緩、靜止震顫以及姿勢異常等。病理表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元減少和路易小體的形成。目前常用的治療藥物有左旋多巴類制劑、B型單胺氧化酶（B-type monoamine oxidase, MAO-B）抑制劑、多巴胺受體激動(dòng)劑以及神經(jīng)修復(fù)制劑等，但這些藥物僅能改善癥狀，并不能完全治愈。而大量研究顯示，線粒體功能障礙與帕金森氏病的發(fā)病有密切聯(lián)系。眾所周知，線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器

2、，參與多項(xiàng)細(xì)胞活動(dòng)，而且具有自己獨(dú)特的遺傳物質(zhì)，當(dāng)線粒體功能發(fā)生障礙時(shí)會導(dǎo)致許多的人類疾病。近年來有研究發(fā)現(xiàn)將功能正常的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體功能受損的受體細(xì)胞后，可以修復(fù)受體細(xì)胞的線粒體功能，恢復(fù)細(xì)胞活力。所以我們將提取純化的正常小鼠肝臟線粒體與帕金森氏病模型細(xì)胞共同孵育，來研究其對帕金森氏病模型細(xì)胞的影響。
　　本研究分為三個(gè)部分：第一部分：分別用質(zhì)粒DsRed2-Mito和 ECFP-Mito轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞（HepG2），用以標(biāo)

3、記線粒體。為得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，又采用慢病毒轉(zhuǎn)染ECFP-Mito，再將穩(wěn)定表達(dá)的肝癌細(xì)胞中熒光標(biāo)記的線粒體提取出來，并與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育，在共聚焦顯微鏡下觀察，證明了外源線粒體可以進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞。第二部分：提取正常昆明小鼠肝臟的線粒體，激光粒度儀測定線粒體粒徑，用電子透射顯微鏡觀察線粒體的內(nèi)部構(gòu)造。并分別用詹姆斯綠 B和MitoTrackr Red CMXRos染色線粒體，在熒光顯微鏡和油鏡下觀察線粒體形態(tài)。運(yùn)用線粒

4、體膜電位檢測探針 JC-1，以及不同濃度 CaCl2分別在熒光分光光度計(jì)和流式細(xì)胞儀下檢測提取純化的線粒體的膜電位以及膜完整性。第三部分：首先，用阿爾瑪藍(lán)檢測外源線粒體與正常SH-SY5Y細(xì)胞共孵育后細(xì)胞活力的變化以及細(xì)胞的生存曲線。再用MPP＋（常用于制備帕金森氏病細(xì)胞模型）處理SH-SY5Y細(xì)胞，構(gòu)建體外帕金森氏病細(xì)胞模型。再將小鼠肝臟線粒體與帕金森氏病的模型細(xì)胞共孵育，用阿爾瑪藍(lán)檢測到加入線粒體后細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，透射電鏡的結(jié)果顯