鐵螯合劑對(duì)血管性癡呆小鼠模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　 血管性癡呆(vasculardementia，VaD)是各種腦血管病引起的獲得性智能損害和認(rèn)知障礙的綜合征，為一種慢性進(jìn)行性疾病。在導(dǎo)致癡呆的眾多病因中，VaD是僅次于Alzheimer病(Alzheimer'sdisease，AD)的第二大病因[1]。隨著全球人口的老齡化和腦血管病發(fā)病率的增高，VaD的發(fā)病率也逐年增高，嚴(yán)重危害著人類健康，并給社會(huì)和家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)壓力。就臨床實(shí)際意義而言，VaD是目前唯一可以

2、預(yù)防的癡呆類型，可能較AD更有預(yù)防和治療價(jià)值[2]，早期合理防治VD可以減輕社會(huì)和家庭的沉重負(fù)擔(dān)。正因如此，近年來(lái)VaD逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 VaD的發(fā)病機(jī)制可能與以下幾個(gè)因素有關(guān)：中樞膽堿能系統(tǒng)功能障礙、氧自由基生成增加、中樞RNA和蛋白質(zhì)合成減少、局部炎癥反應(yīng)及機(jī)體免疫異常等[3]。由于發(fā)病機(jī)制的多樣化，現(xiàn)有治療手段或藥物(如膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA

3、)受體拮抗藥等)均不能完全控制血管性癡呆的所有癥狀或者延緩甚至逆轉(zhuǎn)其進(jìn)程。
　　 最近的研究表明，金屬離子尤其是鐵離子與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生關(guān)系密切[4]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦組織中鐵離子過(guò)負(fù)荷，與阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等的發(fā)病直接相關(guān)。用鐵離子螯合劑來(lái)治療神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物模型，取得了比較樂(lè)觀的效果。
　　 越來(lái)越多的證據(jù)表明AD與VaD經(jīng)常相互伴隨發(fā)病，兩者在病因?qū)W、危險(xiǎn)因素、發(fā)病機(jī)制、病理學(xué)、癥狀

4、學(xué)和疾病轉(zhuǎn)歸等方面都有顯著的重疊。然而鐵離子在血管性癡呆中的作用卻并無(wú)深入探究。
　　 目的:
　　 本研究旨在運(yùn)用兩血管法制備血管性癡呆小鼠模型，觀察不同時(shí)間點(diǎn)小鼠行為學(xué)及腦損傷的關(guān)系。并利用鐵螯合劑--甲磺酸去鐵胺對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其是否對(duì)血管性癡呆模型具有保護(hù)或治療效應(yīng)并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　 第一部分，血管性癡呆小鼠模型的建立和評(píng)價(jià)
　　 方法：采用二血管法即雙側(cè)頸總動(dòng)脈完全阻斷1

5、小時(shí)后再灌注的方法造模，并于造模后第3天開始Morris水迷宮訓(xùn)練，第3、7、14、21天測(cè)懸尾實(shí)驗(yàn)靜止不動(dòng)時(shí)間，第7、14、21天測(cè)定位航行實(shí)驗(yàn)上臺(tái)潛伏期和空間探索實(shí)驗(yàn)跨越平臺(tái)次數(shù)，第21天測(cè)Openfiled實(shí)驗(yàn)休息時(shí)間。第21天觀察小鼠腦組織病理改變(HE染色、尼氏染色)。
　　 結(jié)果：小鼠缺血再灌注組與假手術(shù)組相比，懸尾實(shí)驗(yàn)靜止不動(dòng)時(shí)間、水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)上臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)，空間探索實(shí)驗(yàn)跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義(P＜0.05)；但曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)休息時(shí)間，兩組間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型組不同時(shí)間點(diǎn)之間比較，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，懸尾靜止不動(dòng)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，定位航行上臺(tái)潛伏期逐漸縮短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但空間探索跨越平臺(tái)次數(shù)的增多未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。病理HE染色示模型組較假手術(shù)組海馬區(qū)細(xì)胞層次不清、胞體變小。Nissl染色示模型組較假手術(shù)組海馬神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，著色不均勻，尼氏小體含量明顯減少。
　

7、　 結(jié)論：二血管法制備的血管性癡呆小鼠模型，成模率高，穩(wěn)定性好。
　　 第二部分，鐵螯合劑對(duì)血管性癡呆小鼠模型的作用
　　 方法：將在我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得的雄性ICR小鼠160只隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、血管性癡呆模型+生理鹽水對(duì)照組、血管性癡呆模型+甲磺酸去鐵胺(50mg/kg)干預(yù)組及血管性癡呆模型+甲磺酸去鐵胺(100mg/kg)干預(yù)組，每組40只。各組再次隨機(jī)分成4亞組，每組10只，分別標(biāo)記術(shù)后3d、7d、14d

8、、21d。同實(shí)驗(yàn)第一部分制作動(dòng)物模型，再灌注時(shí)給予甲磺酸去鐵胺或等量生理鹽水干預(yù)，之后2天相同時(shí)間點(diǎn)再次給予去鐵胺或等量生理鹽水干預(yù)。術(shù)后3、7、14、21天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組中的各亞組10只小鼠分別進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)、取血及腦組織勻漿行鐵含量檢測(cè)。
　　 結(jié)果：去鐵胺干預(yù)組較生理鹽水空白對(duì)照組術(shù)后7、14、21d的Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)上臺(tái)潛伏期明顯縮短，懸尾不動(dòng)時(shí)間也明顯縮短(P＜0.05)；而去鐵胺高劑量組與低劑量組相比，

9、上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)在再灌注21d時(shí)去鐵敏不同劑量干預(yù)組較生理鹽水空白對(duì)照組跨越站臺(tái)次數(shù)明顯增多(P<0.05)；而7、14d時(shí)，各組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。再灌注14天時(shí)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠休息時(shí)間，各模型組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 血清鐵及腦組織勻漿鐵檢測(cè)表明：生理鹽水模型組較假手術(shù)組，四個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清及腦組織勻漿鐵含量均明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)：去鐵胺干預(yù)

10、組較生理鹽水空白對(duì)照組，術(shù)后3、7、14三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，血清及腦組織勻漿鐵含量均明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、鐵螯合劑可改善血管性癡呆小鼠與認(rèn)知有關(guān)的行為學(xué)指標(biāo)；
　　 2、血管性癡呆小鼠的血清和腦組織鐵含量明顯升高；
　　 3、鐵螯合劑干預(yù)血管性癡呆小鼠后，血清和腦組織鐵含量明顯降低，說(shuō)明鐵螯合劑可能是通過(guò)螯合血及腦組織中鐵來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。
　　 第三部分;

11、鐵螯合劑對(duì)血管性癡呆小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制探討
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和干預(yù)以及血和腦組織標(biāo)本收集同第二部分。小鼠大腦左半球投入4％多聚甲醛后固定48小時(shí)后投入20％蔗糖/PB溶液4℃浸泡至組織沉底。行冰凍切片，選取額葉皮層區(qū)域分別行免疫組化GST-pi染色和MBP染色，記數(shù)前額葉GST-pi陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目以及測(cè)定MBPDensity/Area。小鼠大腦右半球腦組織勻漿，分別檢測(cè)腦組織總超氧化物歧化酶活力，抑制羥

12、自由基能力、丙二醛含量。血清測(cè)定乙酰膽堿含量、膽堿酯酶活力。
　　 結(jié)果：去鐵胺干預(yù)組較生理鹽水空白對(duì)照組術(shù)后3、7、14、21d腦組織抑制羥自由基能力增強(qiáng)、丙二醛含量減少、T-SOD活力增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。血清乙酰膽堿含量、膽堿酯酶活力在各組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。病理結(jié)果提示：?jiǎn)渭兡Ｐ徒M與假手術(shù)組相比，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)額葉皮層下少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，前額葉皮層髓鞘堿性蛋白(MBP)Densi

13、ty/Area明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而去鐵敏干預(yù)組與生理鹽水空白對(duì)照組相比，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)額葉皮層下少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多、前額葉皮層Density/Area升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、鐵螯合劑可阻斷氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少缺血缺氧誘導(dǎo)的血管性癡呆小鼠模型羥自由基和丙二醛生成，增強(qiáng)SOD活力。這種作用能持續(xù)至缺血再灌注21天。
　　 2、鐵螯合劑可以促進(jìn)血管性癡呆小鼠