川芎嗪對MPTP誘導(dǎo)大鼠中腦多巴胺神經(jīng)元損傷所致帕金森病的腦神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　帕金森?。≒arkinson’Sdisease PD）是一種較為常見的椎體外系變性性疾病，由于其確切的發(fā)病機(jī)制迄今尚不十分明確，仍沒有根治的辦法。臨床上多選用藥物治療延緩病情惡化，但由于長期用藥導(dǎo)致療效降低、毒副作用不耐受等，使患者不得不減少劑量或終止藥物治療。因此，尋找治療效果好、安全性高的PD藥物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是從中藥川芎中提取的有效成分，其被廣泛應(yīng)用于治

2、療神經(jīng)和心血管性疾病。近年來，一些研究已經(jīng)表明，川芎嗪在體內(nèi)外具有神經(jīng)保護(hù)作用。川芎嗪也被發(fā)現(xiàn)具有缺血性腦損傷的保護(hù)作用，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）是一種神經(jīng)毒素，對參與PD發(fā)生的神經(jīng)元具有靶向作用。因此，MPTP已被廣泛應(yīng)用于帕金森病動物模型的建立。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討川芎嗪對MP TP所致大鼠中腦多巴胺神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及可能的抗凋亡抗氧化機(jī)制，為帕金森氏病的臨床治療提供分子基礎(chǔ)

3、。
　　方法：
　　1.動物分組與模型處理
　　大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為:對照組（Con，生理鹽水注射），MPTP組（MPTP與生理鹽水混合注射），TMP組（TMP注射），TMP+MPTP組（TMP與MPTP混合注射）。TMP（TMP20mg/kg/d，TMP溶解于3％DMSO中，腹腔注射）給藥7天。在第7天，大鼠黑質(zhì)（SN）注入MPTP（1μmol MPTP溶解于2μl生理鹽水中，參照坐標(biāo):AP:-5.0

4、mm，ML:±2.1mm，DV:-7.7mm,使用30量規(guī)針頭從大鼠前鹵，中線和頭骨表面以0.35μl/min的速度注入），隨后繼續(xù)TMP給藥7天。步行階梯實(shí)驗(yàn)在第14天的14:00-18:00經(jīng)行。實(shí)驗(yàn)后，將大鼠處死并解剖，取出紋狀體和黑質(zhì)以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.步行階梯實(shí)驗(yàn)
　　步行階梯實(shí)驗(yàn)用于評價大鼠前后肢體的協(xié)調(diào)能力。在測試前大鼠被訓(xùn)練3天進(jìn)行橫跨梯子的訓(xùn)練，記錄第14天進(jìn)行的3次測試的平均成績。
　　3.多巴

5、胺及其代謝產(chǎn)物的測定
　　大鼠脫頸髓處死，冰臺上迅速斷頭將紋狀體取出，稱重，于-80℃儲存。檢測時加入含有DHBA內(nèi)標(biāo)的0.1mol/L的高氯酸溶液0.5ml，勻漿，于4℃低溫離心，15000r/min，離心l0min，取上清50μl用于高效液相色譜電化學(xué)檢測。
　　4.TBARS和GSH的測定
　　參照說明書方法測定巴比土酸活性物質(zhì)（TBARS）和谷胱甘肽（GSH）含量
　　5.免疫組化染色
　　將處理后

6、的大鼠腦組織-20℃冷凍并連續(xù)切片（5um）,置于玻璃載玻片上，在4oC下細(xì)胞與特異性抗體共同孵育過夜，與Cy3抗體共同培養(yǎng)。然后置于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。
　　6.免疫組化檢測酪氨酸羥化酶（TH）陽性細(xì)胞數(shù)
　　造模一周后大鼠斷頭處死，在冰上取中腦腹側(cè)，立即將其置于4％多聚甲醛中固定，蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片，以15μm厚度連續(xù)切片，晾片后加大鼠抗TH單克隆一抗（1:1000），37℃下孵育l小時，PBS洗3次每次5分鐘，

7、加入熒光標(biāo)記的兔抗大鼠二抗，37℃孵育60分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘經(jīng)封皮后熒光顯微鏡鏡下觀察黑質(zhì)致密部（SNc）的TH陽性細(xì)胞數(shù)，圖像分析系統(tǒng)計數(shù)，每組取5個動物，每個動物取5張切片，計算平均數(shù)值。
　　7. Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平
　　結(jié)果：
　　1.川芎嗪對MPTP誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙的影響
　　與Con組大鼠相比，MPTP組大鼠明顯花費(fèi)更多時間通過階梯，證實(shí)MPTP誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生運(yùn)動

8、障礙；與MPTP組相比，TMP+MPTP組大鼠通過階梯時間明顯縮短，結(jié)果表明，TMP的干預(yù)，使MPTP誘導(dǎo)的大鼠運(yùn)動障礙得到改善。
　　2.川芎嗪對MPTP誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷的影響
　　與Con組相比，MPTP組大鼠酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)明顯減少，DA和DOPAC水平明顯降低；應(yīng)用TMP干預(yù)后，抑制了DA和DOPAC水平的降低，可顯著防止MPTP誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷。
　　3.TMP對MPTP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響<

9、br>　　為了評估細(xì)胞凋亡的相關(guān)改變，我們檢測Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)。在黑質(zhì)中，MPTP組大鼠Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。而MPTP誘導(dǎo)的Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)改變能被TMP有效抑制。另外，我們檢測了細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素c的釋放，與Con組相比，MPTP組細(xì)胞色素c釋放增多，而TMP干預(yù)后細(xì)胞色素c的釋放得到有效抑制。
　　我們同時也檢測了capase3的剪切，MPTP可促進(jìn)capase3發(fā)生剪切，而TMP

10、可顯著降低capase3的剪切。這些結(jié)果說明TMP可抑制MPTP誘導(dǎo)的大鼠大腦黑質(zhì)細(xì)胞凋亡。
　　4.TMP對MPTP誘導(dǎo)的誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響
　　我們檢測了TMP和MPTP對大鼠大腦黑質(zhì)氧化還原平衡的影響。與Con組相比，MPTP組TBARS水平顯著增加；說明MPTP引起了氧化損傷的發(fā)生。而TMP干預(yù)后可有效抑制TBARS水平的增高。MPTP組與Con組相比，GSH含量顯著降低。而TMP干預(yù)后可以有效抑制其降低。與Con

11、組相比，MPTP組Nrf2和GCLc表達(dá)明顯降低降低。而TMP干預(yù)后能有效抑制Nrf2和GCLc的表達(dá)降低。這些結(jié)果說明TMP可抑制MPTP誘導(dǎo)的大鼠大腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激損傷。
　　結(jié)論：
　　1. 川芎嗪可以改善MPTP誘導(dǎo)的大鼠運(yùn)動障礙并可顯著防止MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷。
　　2．川芎嗪的抗凋亡，抗氧化作用是其產(chǎn)生保護(hù)神經(jīng)元損傷作用的可能機(jī)制。
　　3．川芎嗪的抗凋亡作用是通過其抑制Bax表達(dá)，增加Bc