Ghrelin對MPTP小鼠中腦多巴胺能神經元的保護作用及可能機制研究.pdf

1、帕金森病(parkinson’s disease，PD)是一種常見的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，以肌強直、肢體震顫和運動減少等癥狀為主要臨床表現(xiàn)。PD病理特征主要是中腦黑質致密帶(substantia nigra pars compact，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神經元死亡。PD的病因未完全明了，可能有多種因素參與，如遺傳、環(huán)境因素、氧化應激、興奮生毒素、自身免疫、黑質(substantia nigra，SN)、鐵聚積和

2、細胞凋亡等。近年來對PD中DA能神經元死亡機制的大量研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡在PD發(fā)病中起著重要的作用，應用電鏡技術可在DA能細胞中觀察到染色質濃縮和凋亡小體等特征，能夠抑制細胞凋亡的物質可以保護DAN能神經元。 Ghrelin是Kojima等1999年發(fā)現(xiàn)的一種腦．腸肽，由28個氨基酸殘基組成，為生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)的內源性配體，有刺激食欲，促進

3、攝食，減少能量消耗和增加體重等作用。最近的研究表明Ghrelin能夠刺激脂肪前體細胞、成骨細胞多種細胞的增殖并具有抑制凋亡的作用，GHS-R1a特異性拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6能阻斷其抑制脂肪前體細胞和體外培養(yǎng)的下丘腦神經元凋亡的作用。由于Ghrelin的功能性受體GHS-R 1a mRNA在SN DA能神經元有較高表達，為研究Ghrelin是否能夠保護SN DA能神經元并探索其作用的可能機制，本實驗選擇了MPTP制備小鼠P

4、D模型，應用免疫熒光雙標技術在蛋白水平上觀察SNpc GHS-R 1a與酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxlase，TH)共存的情況，利用高效液相色譜電化學檢測法(high performance liquid chromatography-electrochemicaldetection，HPLC-ECD)和免疫組織化學的方法觀察Ghrelin對紋狀體(striatum，Str)DA及其代謝產物二羥基苯乙酸(dihydrox

5、yphenylace-tic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量經及SNpc DA能神經元存活情況的影響；為了進一步研究Ghrelin的神經保護作用機制，我們采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(semi-quantitive reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和免疫組織化學法檢測Ghrelin對SN TH、caspas

6、e-3、Bcl-2和Bax表達的影響；同時，我們應用GHS-R1a的特異性拮抗劑-D-nys<'3>-GHRP-6觀察其對Ghrelin神經保護作用的影響。結果如下： 1．TH與GHS-R 1a在C57BL/6小鼠的SNpc共存。 2.MPTP造成小鼠Str DA、DOPAC和HVA含量的減少以及DA代謝率的升高(P<0.05)，較高劑量的Ghrelin(200ng，400ng)對于防止DA及其代謝產物的減少和抑制DA代

7、謝率升高有明顯的作用，可以有效減輕MPTP的毒性損傷作用。單獨側腦室注射Ghrelin對于小鼠Str DA及其代謝產物的含量及DA代謝率沒有明顯改變(P>0.05)。應用GHS-R 1a的拮抗劑，D-LVs3-GHRP-6，可以阻斷Ghrelin的上述作用。 3.MPTP導致小鼠SN TH mRNA表達量降低(P<0.05)，TH免疫陽性細胞數(shù)目減少(P<0.05)。100ng、200 ng和400 ng Ghrelin可結抗M

8、PTP造成的DA能神經元缺失及TH mRNA表達降低。Ghrelin組的TH免疫陽性細胞數(shù)及其mRNA表達量與Control組無統(tǒng)計學差別(P>0.05)。Ghrelin受體GHS-R 1a的拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6可以完全阻斷Ghrelin對DA能神經元的保護作用。 4.MPTP組小鼠SNpc的caspase-3免疫陽性細胞與Control組相比顯著增加(P<0.05)，且組織著色加深。Ghrelin對MPTP造

9、成caspase-3活性增加的抑制具有劑量依賴性，50 ng與100 ng不能減少caspase-3免疫陽性細胞的數(shù)量，200 ng和400 ng與50 ng與100 ng相比，具有明顯的抑制作用(P<0.05)。Ghrelin組SNpc的caspase.3免疫陽性細胞數(shù)目和Control組相比無明顯差別(P>0.05)。拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6可以阻斷Ghrelin下調caspase-3免疫陽性神經元的作用。 5

10、.MPTP PD模型小鼠與正常小鼠相比，SN Bcl-2 mRNA表達量及免疫陽性細胞數(shù)目減少(P<0.05)。100 ng、200 ng和400 ng Ghrelin可以隨劑量增加逐步逆轉MPTP造成的Bcl-2 mRNA表達量和免疫陽性細胞減少的狀況。Ghrelin對正常小鼠SN Bcl-2 mRNA和蛋白水平并無影響(P>0.05)。GHS-R 1a的拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6可以阻斷Ghrelin對Bcl-2的上調作

11、用。 6.MPTP組小鼠SN Bax mRNA表達量顯著高于正常小鼠(P<0.05)，Ghrelin各個劑量組(50 ng、100 ng、200 ng和400 ng)對由MPTP造成的Bax mRNA的表達量增加都有抑制作用(P<0.05)，該抑制作用隨Ghrelin劑量的增加而增強。Ghrelin對Bax表達的抑制可以完全被GHS-R 1a拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6阻斷。Ghrelin組和Control組的表達量沒

12、有差別。 7.Ghrelin可以使正常小鼠SN Bcl-2/Bax的比值變大(P<0.05)，MPTP導致小鼠SN Bcl-2/Bax顯著低于正常小鼠(P<0.05)。50 ng Ghrelin即可緩解MPTP降低Bcl-2/Bax的狀況(P<0.05)，200 ng和400 ng Ghrelin可逆轉Bcl-2/Bax比值的降低(P<0.05)。D-Lys<'3>-GHRP-6組Bcl-2/Bax與MPTP組相比差別無統(tǒng)計學意

13、義。上述結果說明，MPTP可引起SN TH蛋白和mRNA表達水平降低，Str DA及其代謝產物含量減少，DA代謝率升高；給予Ghrelin之后，可以明顯減輕MPTP的神經毒性作用，增加SN TH mRNA的表達，減輕DA能神經元缺失的狀況，升高Str DA及其代謝產物含量；該保護作用是通過增加Bcl-2 mRNA的表達和蛋白含量，抑制Bax mRNA的表達以及caspase-3的活性而實現(xiàn)的；Ghrelin的細胞保護作用由GHS-R 1