Ghrelin對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及可能機(jī)制的研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見(jiàn)于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密帶(substantia nigra pars compact，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元死亡。迄今為止，PD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究證實(shí)在各種神經(jīng)變性機(jī)制中，氧化應(yīng)激占主導(dǎo)地位，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡起著重要的作用。因此，尋找一種天然、高效的抗氧化藥物具有重要的臨床意義。
　　

2、 Ghrelin是由日本科學(xué)家Kojima于1999年發(fā)現(xiàn)的一種新的由28個(gè)氨基酸組成的腦腸肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)的天然性配體。Ghrelin能夠和GHS-R1a結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)功能。GHS-R1a是具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白耦聯(lián)的受體。文獻(xiàn)報(bào)道GHS-R1a具有固有活性，即在無(wú)激動(dòng)劑條件下，受體固有的維持激活并維持下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性。這將

3、為PD的治療開(kāi)辟一個(gè)新領(lǐng)域。研究表明ghrelin除了促進(jìn)攝食，調(diào)節(jié)能量代謝，還具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡、調(diào)節(jié)睡眠和記憶等功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示ghrelin能通過(guò)GHS-R1a拮抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）對(duì)小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用。但具體機(jī)制尚不是十分清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)在MES23.5多巴胺能神經(jīng)

4、細(xì)胞上，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)，免疫蛋白印跡等技術(shù)，研究了ghrelin對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶陽(yáng)離子(l-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)處理的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討了其抗氧化作用的可能機(jī)制。同時(shí)在MPTP制備的PD小鼠模型上，應(yīng)用高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法(high pe

5、rformance liquid chromatography-electrochemical detection,HPLC-ECD),RT-PCR及免疫組織化學(xué)等方法觀察了黑質(zhì)區(qū)高表達(dá)GHS-R1a對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：表明：
　　 1.200μmol/LMPP+處理的MES23.5細(xì)胞中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平明顯高于正常組(P＜0.01)。而10-9mol/Lghre

6、lin預(yù)處理會(huì)明顯減輕MPP+引起的MDA水平的升高(P＜0.01)。
　　 2．MES23.5細(xì)胞在MPP+處理24h后，過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）mRNA、蛋白水平和超氧化物岐化酶(Cu/Zn-superoxidedismutase，Cu/Zn-SOD)蛋白水平與正常組相比均明顯降低（P＜0.01）。Ghrelin預(yù)處理能明顯增加上述mRNA及蛋白的表達(dá)水平(P＜0.01)。
　　 3．MPP+處理的ME

7、S23.5細(xì)胞Bax/Bcl-2比值和有活性的caspase-3蛋白表達(dá)比正常組明顯增加(P＜0.01)。而ghrelin預(yù)處理后上述變化明顯減輕。
　　 4．Ghrelin可以增加MES23.5細(xì)胞核內(nèi)的核因子相關(guān)因子2（nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）蛋白的表達(dá)水平。從3h到24h，Nrf2蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)。
　　 5．MPP+處理后MES23.5細(xì)

8、胞核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)出現(xiàn)明顯的核移位，ghrelin預(yù)處理會(huì)減輕MPP+誘導(dǎo)的NF-κB的核移位。
　　 6．重組腺病毒質(zhì)粒pAdGHS-R1a經(jīng)PacⅠ酶切后獲得一大約30kb的大片段和4.5kb的小片段。Ad-GHS-R1a轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，GHS-R1a基因能在293細(xì)胞中有效表達(dá)。
　　 7．小鼠黑質(zhì)注射Ad-GHS-R1a后，黑質(zhì)GHS-R1a的表達(dá)水平明顯增加。小鼠黑

9、質(zhì)高表達(dá)GHS-R1a能拮抗MPTP造成的小鼠紋狀體(striatum，Str)DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)和高香草酸(homovanillicacid,HVA)含量的減少以及DA代謝率的升高(P＜0.05)。
　　 8．小鼠黑質(zhì)高表達(dá)GHS-R1a可拮抗MPTP造成的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元缺失及酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxlase，TH)mRNA表達(dá)降