內(nèi)源性Ghrelin受體在MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，其主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine, DA）能神經(jīng)元選擇性死亡，以及殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）的異常聚集，形成Lewy小體（Lewy bodies，LBs）。由于釋放到紋狀體（striatum，Str）的DA減少，造成基底神經(jīng)節(jié)的直接通路和間接通路失衡，引起靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動遲緩和

2、姿勢反射障礙等臨床表現(xiàn)。到目前為止，PD的病因尚未明確，遺傳、環(huán)境、老齡化、氧化應(yīng)激，炎癥等因素均參與了PD黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性死亡的過程。
　　Ghrelin作為一種內(nèi)源性腦腸肽，是生長激素促分泌素受體（growth hormone secretagogue receptor, GHS-R）的唯一內(nèi)源性配體，GHS-R主要有1a和1b兩種亞型，其中1a亞型是其主要的功能性受體。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GHS-R1a主要分布在下丘腦、垂體

3、、海馬、中腦、黑質(zhì)等部位，具有調(diào)節(jié)生長激素分泌，食物攝入、能量代謝及神經(jīng)保護(hù)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可以通過激活其受體GHS-R1a介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，使黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的興奮性增加，從而導(dǎo)致紋狀體的DA釋放量增加和代謝率增高。Ghrelin還可以通過其受體激活的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過抗氧化、抗炎和抗凋亡機(jī)制拮抗神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3

4、,6- tetrahydropyridine, MPTP）誘導(dǎo)的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷。并且在Ghrelin存在的條件下，外源性過表達(dá)GHS-R1a可以顯著拮抗1-甲基-4-苯基吡啶陽離子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+）誘導(dǎo)的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷。以上結(jié)果提示，在PD中，Ghrelin能夠通過與其受體GHS-R1a結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。同時，也有研究指出，在沒有天然配體Ghrelin存在的

5、情況下，GHS-R1a也能夠與多種G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)生二聚化形成異源二聚體，如多巴胺1型受體（dopamine type1 receptor，D1R），多巴胺2型受體（dopamine type2 receptor，D2R），黑皮質(zhì)素3型受體（melanocortin-3 receptor，MC3R），血清素2C型受體（serotonin type2C receptor，5-HT2C）和大麻素1型受體（cannabinoid type1

6、receptor，CB1）等，進(jìn)而通過激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程發(fā)揮重要的生理功能。但是內(nèi)源性GHS-R1a在PD中黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷中的作用尚未見任何報道。
　　為了探討內(nèi)源性GHS-R1a在PD中黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷中的作用及其機(jī)制，本實驗擬在Ghrelin受體敲除的小鼠（Ghsr+/-小鼠）上，給予MPTP腹腔注射，觀察Ghrelin受體敲除對MPTP所致的小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的影響。實驗分為四組，WT-NS組、WT-MP

7、TP組、Ghsr+/--NS組以及Ghsr+/--MPTP組，分別給予腹腔注射MPTP或者NS5 w，應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)（high-performance liquid chromatography, HPLC）觀察Str區(qū)DA含量的變化；應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，觀察中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）陽性細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量變化；應(yīng)用Western blots技術(shù)檢測黑質(zhì)區(qū)TH、超氧化物歧化酶1（sup

8、eroxide dismutase1，SOD1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的蛋白表達(dá)變化以及Bcl-2/Bax比值的變化，以期闡明內(nèi)源性GHS-R1a在PD中黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷中的作用。結(jié)果如下：
　　1. MPTP注射1 w、3 w和5 w后，WT小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)量分別減少了16%、34%和48%，TH蛋白表達(dá)水平分別降低了26%、51%和44%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而Gh

9、sr+/-小鼠，MPTP注射1 w、3 w和5 w后，黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)量分別減少了40%、50%和58%，TH蛋白表達(dá)水平分別降低了42%、61%和74%，與對照組相比，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與WT-MPTP組小鼠相比，Ghsr+/--MPTP組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞的數(shù)量分別減少了33%、26%和30%，TH蛋白表達(dá)水平分別降低了21%、40%和59%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2. MPTP注

10、射5 w后，WT小鼠Str內(nèi)DA含量由13.81±0.27 ng/mg降低至6.65±0.67 ng/mg，與對照組相比，降低了51%，差別具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而Ghsr+/-小鼠，MPTP注射5 w后，Str內(nèi)DA含量由11.67±2.25 ng/mg降低至3.81±0.49 ng/mg，與對照組相比，降低了67%，與WT-MPTP組小鼠相比，降低了42%，差別具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3. MP

11、TP注射5 w后，WT小鼠黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加了66%，與對照組相比，差別具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。而Ghsr+/-小鼠，MPTP注射3w后，黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量即增加了60%，注射5 w后，增加了107%，與對照組相比，差別具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與WT-MPTP組小鼠相比，Ghsr+/--MPTP組小鼠黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在MPTP注射5 w后，增加了31%，差別具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

12、r>　　4.在MPTP注射5 w后，WT-MPTP小鼠黑質(zhì)IL-6蛋白表達(dá)量上升了33%，而Ghsr+/--MPTP小鼠黑質(zhì)IL-6蛋白表達(dá)量上升了65%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與WT-MPTP小鼠對比，Ghsr+/--MPTP小鼠黑質(zhì)區(qū)IL-6蛋白表達(dá)量增加了23%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5. Western blots檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MPTP注射3 w和5 w后，WT小鼠黑質(zhì)區(qū)SOD1蛋白表達(dá)

13、量分別降低了29%和36%，而Ghsr+/-小鼠，在MPTP注射3 w和5 w后，黑質(zhì)區(qū)SOD1蛋白表達(dá)量分別降低42%和63%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與WT-MPTP小鼠對比，Ghsr+/--MPTP小鼠黑質(zhì)SOD1蛋白表達(dá)量在MPTP注射5 w后減少了42%。
　　6. WT小鼠在給藥5 w后，黑質(zhì)Bcl-2/Bax比值降低了30%，差別具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），而Ghsr+/-小鼠在給藥3 w后，黑

14、質(zhì)Bcl-2/Bax比值就降低了33%，5 w后降低了50%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與WT-MPTP小鼠對比，Ghsr+/--MPTP小鼠黑質(zhì)Bcl-2/Bax比值在MPTP注射5 w后降低34%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　綜上所述，內(nèi)源性GHS-R1a的缺失能夠明顯增強(qiáng)MPTP的神經(jīng)毒性作用，在MPTP注射的早期，即出現(xiàn)中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷，表現(xiàn)為TH陽性細(xì)胞數(shù)量的減少和TH蛋白表達(dá)水平的降低