星形膠質(zhì)細(xì)胞在脂多糖誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷中的作用.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 脂多糖通過上調(diào)Toll樣受體表達(dá)、激活MAPK通路和NF—κB通路，介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長雙重性 目的：研究不同濃度脂多糖作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時間后星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長特性，脂多糖受體表達(dá)情況，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部信號通路激活情況。 方法：在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入不同濃度的脂多糖分別作用不同時間，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞生長的情況，MAPK通路抑制劑和NF—κB通路抑制劑對星形膠質(zhì)細(xì)胞生長

2、的影響。同時以不同濃度的LPS作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24h后，觀察隨后8d星形膠質(zhì)細(xì)胞生長的變化。通過RT—PCR、Western—blot、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞Toll樣受體的基因水平、蛋白水平和細(xì)胞水平的表達(dá)。Western—blot檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子p65和P—p38的表達(dá)情況，觀察MAPK通路抑制劑對P—p38表達(dá)及NF—κB通路抑制劑對p65表達(dá)的影響。 結(jié)果：只有在作用24h后，低劑量的脂多糖才

3、可使星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長加快，高劑量的脂多糖則可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。以≤10mg/L的脂多糖作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24h后，短期內(nèi)都可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長，長期則抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長，脂多糖濃度越大，抑制細(xì)胞生長的能力越明顯。NF—κB通路抑制劑、MAPK通路抑制劑皆可阻斷脂多糖對星形膠質(zhì)細(xì)胞生長的影響。在正常狀況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞在胞漿和胞膜表達(dá)大量的TLR3受體，很少的TLR4受體。在脂多糖的刺激下，星形膠質(zhì)細(xì)胞的TLR3受體表達(dá)保持

4、不變，TLR4受體的表達(dá)隨予以脂多糖的濃度增加而增高。予以10mg/L脂多糖作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時間，我們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)各組皆有P—p38表達(dá)，基礎(chǔ)水平為內(nèi)參GAPDH的0．176±0．021倍，30min后明顯升高，24h后達(dá)到高峰，達(dá)GAPDH的0．435±0．044倍，隨后逐漸減弱，48h組和72h組僅為GAPDH的0．287±0．028倍。預(yù)先加用MAPK通路抑制劑PD98059可下調(diào)P—p38的表達(dá)。同樣，p65蛋白表達(dá)

5、高峰出現(xiàn)在24h，隨后下降，NF—κB通路抑制劑可阻斷p65蛋白的升高。 結(jié)論：低劑量的脂多糖可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞生長，高劑量時則抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長，而炎癥刺激對星形膠質(zhì)細(xì)胞的長期影響是對細(xì)胞的生長增殖起抑制作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞Toll樣受體的表達(dá)是不同源的，TLR4隨環(huán)境的變化而改變。其分子機(jī)制可能與NF—κB通路、MAPK通路的激活有關(guān)。 第二部分 星形膠質(zhì)細(xì)胞在脂多糖誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷中起雙重作用 目的

6、：（1）建立含有高比例多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元培養(yǎng)體系。（2）建立星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的共培養(yǎng)體系。（3）研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同濃度脂多糖誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷中的作用。 方法：利用L—抗壞血酸—2—磷酸酯倍半鎂鹽和人成纖維生長因子促進(jìn)孕12d的SD大鼠中腦前體細(xì)胞擴(kuò)增、分化為多巴胺能神經(jīng)元，通過阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，建立高比例多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元培養(yǎng)體系。原代培養(yǎng)純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，使用終濃度為0、0．1、10mg/L

7、脂多糖分別作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24h，收集細(xì)胞上清液，高速離心，去除雜質(zhì)，獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液（ACM）。在此基礎(chǔ)上，利用transwell雙室培養(yǎng)系統(tǒng)建立星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，觀察脂多糖、星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液和星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元培養(yǎng)體系中多巴胺能神經(jīng)元存活及酪氨酸羥化酶mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：脂多糖對神經(jīng)元體系中的多巴胺能神經(jīng)元有損傷作用，并呈劑量依賴性。同單用脂多糖相比，條件培養(yǎng)液顯著促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元

8、的存活，其中0．1mg/L脂多糖處理的ACM組多巴胺能神經(jīng)元的存活能力最強(qiáng)，其次為10mg/L組，最后為0mg/L組。同條件培養(yǎng)液組相比，共培養(yǎng)體系中多巴胺能神經(jīng)元存活能力更高，其中0．1mg/L脂多糖干預(yù)后多巴胺能神經(jīng)元的存活能力最強(qiáng)，隨后依次為10mg/L、0mg/L、20mg/L脂多糖。多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)酪氨酸羥化酶mRNA的變化類似多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的變化。 結(jié)論：脂多糖對多巴胺能神經(jīng)元有損傷作用，并呈劑量依賴性，適度激

9、活的星形膠質(zhì)細(xì)胞對多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用，過度激活則削弱了這種保護(hù)作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元之間的對話可進(jìn)一步增加多巴胺能神經(jīng)元的存活。 第三部分 脂多糖刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過IL—6介導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖雙重性 目的：研究脂多糖刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對PC12細(xì)胞生長的影響及其可能的因子。 方法：在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入不同濃度的脂多糖作用24h，收集條件培養(yǎng)液，用不同分子量的過濾單位（

10、Ultrafree MC filter units）將培養(yǎng)液進(jìn)行分層處理，觀察不同分子量范圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對PC12細(xì)胞生長的影響，同時對星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子進(jìn)行分析，觀察以不同濃度的脂多糖作用24h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的變化。觀察重組IL—6和加用IL—6中和抗體后的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對PC12細(xì)胞生長的影響。最后在含高比例多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元培養(yǎng)體系中，加用添加IL—6中和抗體的星形膠質(zhì)細(xì)胞

11、條件培養(yǎng)液，觀察他們對多巴胺能神經(jīng)元存活及酪氨酸羥化酶mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液可促進(jìn)PC12細(xì)胞的增殖，低劑量的脂多糖刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液可增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞對PC12細(xì)胞的增殖作用，高劑量的脂多糖則可削弱星形膠質(zhì)細(xì)胞對PC12細(xì)胞的影響。5—30KDa分子量范圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對PC12細(xì)胞的影響最大。以脂多糖作用星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，脂多糖可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL—6，并呈劑量依賴

12、性，GDNF、TNF—α、NO的分泌影響不大，未達(dá)統(tǒng)計性差異。低劑量脂多糖促進(jìn)GSH合成、上調(diào)GPx活性，高劑量則起相反作用，重組IL—6可模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液的作用，IL—6中和抗體可阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液的這種效應(yīng)。IL—6中和抗體加入到ACM中，消除ACM中IL—6的作用后，0、0．1mg/L脂多糖處理組多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量下降，細(xì)胞突起變短，暗淡，但10mg/L脂多糖處理組多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量沒有下降，突起較未加IL—