TRPC3在脂多糖誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中作用.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中數(shù)量最多的一種膠質(zhì)細(xì)胞。最初認(rèn)為,星形膠質(zhì)細(xì)胞可作為大腦的填充細(xì)胞,支持和保護(hù)神經(jīng)元。但越來越多的研究證明星形膠質(zhì)細(xì)胞還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外液離了濃度、pH值、葡萄糖水平和清除神經(jīng)遞質(zhì)等活動(dòng)參與神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持,并且在促進(jìn)突觸形成、維護(hù)突觸正常功能,調(diào)控神經(jīng)元信息,調(diào)節(jié)腦血管緊張性,調(diào)節(jié)免疫功能及成年神經(jīng)發(fā)生中均起作用。
　

2、　 星形膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)對(duì)各種損傷時(shí)發(fā)生活化,稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞,表現(xiàn)為損傷局部星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、胞體肥大、突起增多、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glialfibrillary acid protein,GFAP)表達(dá)上調(diào),伴隨這些形態(tài)學(xué)的變化,細(xì)胞還發(fā)生一系列生理功能的改變,包括分泌各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和釋放細(xì)胞毒性物質(zhì),如:一氧化氮(Nitric oxide,NO)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF

3、-α))、白細(xì)胞介素-1β(Interlukin 1β,IL-1β)和IL-6等?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)或毒性作用,從而發(fā)揮“雙刃”效應(yīng)。因此,將星形膠質(zhì)細(xì)胞作為治療CNS系統(tǒng)疾病靶點(diǎn)具有挑戰(zhàn)性,選擇件地作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞,盡量減少損害是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病最理想策略。但是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的雙重角色,增加了治療的難度。
　　 鈣是重要的胞內(nèi)信使,在可興奮細(xì)胞和非興奮細(xì)胞的功能活動(dòng)中均發(fā)揮重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

4、增加是細(xì)胞“興奮”的一種表現(xiàn)。在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease,AD)以及亨廷頓病等神經(jīng)變件疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中,鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變。鈣穩(wěn)態(tài)失衡和異常的鈣信號(hào)可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的一個(gè)關(guān)鍵因素。TRPC(Canonicaltransient receptor potential,TRPC)通道是一類非選擇性鈣離子通道,能夠感受細(xì)胞內(nèi)外的多種刺激。TRPC通

5、道包括7個(gè)亞族,即TRPC1-7。近年來的研究表明,TRPC通道作為一類新發(fā)現(xiàn)的Ca2+通道,在調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+平衡、傳遞胞外信號(hào)方面發(fā)揮重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞上有TRPC1-7基因表達(dá),其中TRPC1和TRPC3表達(dá)水平較高。研究證實(shí),TRPC3參與多種疾病的病理生理過程,但是否參與CNS疾病過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,目前尚未見報(bào)道。
　　 脂多糖(liposaccharide,LPS)是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分,LPS

6、主要與TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合,引起CNS炎癥反應(yīng)。本課題在上述理論的基礎(chǔ)上,應(yīng)用LPS建立體外星形膠質(zhì)細(xì)胞活化模型,通過熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)TRPC3在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的變化,應(yīng)用共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化。同時(shí)通過藥理學(xué)方法阻斷TRPC通道的活性,觀察細(xì)胞增殖、GFAP表達(dá)、IL-6分泌及[Ca2+]i變化,進(jìn)一步闡明TRPC3在星

7、形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用,為研究神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的理論依據(jù)。
　　 首先,我們觀察LPS對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。我們分別觀察了不同劑量LPS和LPS作用不同時(shí)間后的效果。依據(jù)參考文獻(xiàn),我們觀察0.25μg/ml、0.5μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml不同濃度的LPS作用48 h細(xì)胞增殖情況。MTS和BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖隨LPS濃度的增加而增加,與對(duì)照組相比

8、,細(xì)胞活性分別增加了32.00％、44.69％、48.17％、58.45％和55.20％(p<0.01),而BrdU陽性細(xì)胞百分比分別增加了33.88％、37.71％、49.10％、53.66％和39.62％(P<0.01)。由此可見,LPS呈劑量依賴性促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。我們選擇0.5μg/ml LPS來觀察LPS作用不同時(shí)間后對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響。0.5μg/ml LPS作用24 h和48 h后,星形膠質(zhì)細(xì)胞活性分別為146.

9、37％和1.55.36％,而不加LPS的細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h和48 h后,其活性分別為119％和124.08％,LPS作用24 h和48 h均能顯著增加細(xì)胞活性(p<0.05)。因此,后續(xù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)選用0.5μg/ml LPS作用48 h。
　　 GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白,被公認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特征性標(biāo)記物,在病理狀態(tài)下出現(xiàn)反應(yīng)性上調(diào),其上調(diào)機(jī)制尚未完全闡明。接下來我們通過觀察0.5μg/ml LPS分別作用2

10、h、6 h、12 h、24 h、48 h后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)情況來了解細(xì)胞活化的情況。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,0.5ug/ml LPS作用2 h后,GFAP表達(dá)顯著增加,LPS作用2-48 h后星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP的表達(dá)分別為對(duì)照組的2.16倍、2.03倍、2.36倍、2.31倍、2.30倍(p<0.01)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LPS作用星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h后胞漿GFAP熒光明顯增強(qiáng),一直持續(xù)到48 h,

11、進(jìn)一步證實(shí)LPS可誘導(dǎo)GFAP表達(dá)。
　　 IL-6為大家熟悉的免疫炎性因子,為檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后是否通過釋放IL-6參與炎癥反應(yīng),我們檢測(cè)了LPS對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中 IL-6變化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,生理情況下,IL-6分泌量很低,為1.90 pg/ml。LPS作用2 h后即升高到32.02 pg/ml(P<0.01),并隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)分泌持續(xù)升高,LPS作用48 h后升高到242.58 pg/ml。提示LPS能夠促進(jìn)炎件細(xì)

12、胞因子IL-6的分泌。
　　 由于TRPC通道是非選擇性陽離子通道,能夠介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流,使細(xì)胞內(nèi)鈣離了濃度(Intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)升高,而[Ca2+]i升高是星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮的標(biāo)志。我們接下來觀察LPS對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC3的影響。用熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)LPS對(duì)TRPC3表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 ug/ml

13、LPS處理2 h后,TRPC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,一直持續(xù)到48 h。LPS處理2-48 h后,TRPC3 mRNA表達(dá)水平分別為對(duì)照組的3.47倍、6.2倍、6.24倍、7.44倍和3.33倍,蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的1.84倍、2.25倍、2.32倍、2.45倍和1.91倍。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,正常星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和核內(nèi)均有TRPC3表達(dá),核內(nèi)表達(dá)水平較高,而LPS誘導(dǎo)胞漿和核內(nèi)TRPC3表達(dá)增強(qiáng)。
　　 為驗(yàn)證T

14、RPC3是否參與LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化反應(yīng),我們利用2-APB和SKF96365兩種TRPC通道阻斷劑來觀察LPS對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、GFAP表達(dá)和IL-6分泌的影響。MTS和BrdU結(jié)果顯示,2-APB和SKF96365呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。與LPS組相比,不同濃度2-APB組細(xì)胞活性分別降低到128.77％、127.92％、114.01％、111.78％和107.60％,BrdU陽性細(xì)胞百分比降低到15

15、2.07％、140.45％、129.22％、119.42％、107.48；而不同濃度SKF96365組細(xì)胞活性分別降低到139.26％、127.08％、126.82％、122.56％和116.83％,BrdU陽性細(xì)胞百分比降低到127.42％、127.90％、126.32％、122.12％和108.09％。流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)一步顯示,LPS能誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入S期和M期,而10 μM 2-APB和5 μM SKF96365使細(xì)胞停滯

16、在G0/G1期(p<0.01),從而抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。同樣,我們觀察了2-APB和SKF96365兩種-TRPC通道阻斷劑處理后對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白GFAP表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,10μM 2-APB可以使GFAP的表達(dá)由LPS組的2.50倍降低到1.58倍(p<0.01),而5μM SKF96365可以使GFAP的表達(dá)由LPS組的3.17倍降低到1.97倍(p<0.05)。提示2-APB和SKF96365通過抑制TRPC

17、通道的作用從而阻斷LPS引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)。MTS實(shí)驗(yàn)和DAPI染色顯示,2-APB(10 μM)和SKF96365(5 μM)對(duì)正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞沒有毒性,也不影響GFAP的表達(dá)。此外,2-APB和SKF96365可以影響IL-6的分泌水平,其中 2-APB可使IL-6分泌水平由LPS誘導(dǎo)后的362.05 pg/ml降低到142.73 pg/ml(p<0.01),SKF96365可以使其降低到224.34 pg/ml(

18、p<0.05)。
　　 由于TRPC通道與[Ca2+]i變化關(guān)系密切,我們首先觀察LPS急性作用后,星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i的變化,用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。結(jié)果顯示,灌流液存在1.3mM Ca2+時(shí),5 μg/ml LPS引起瞬時(shí)[Ca2+]i升高并維持在較高水平,而在無鈣灌流液中,LPS僅誘導(dǎo)瞬時(shí)[Ca2+]i升高,表明LPS誘導(dǎo)的瞬時(shí)[Ca2+]i升高是由細(xì)胞內(nèi)鈣釋放引起,而隨后出現(xiàn)的持續(xù)[Ca2+]i升高是由胞外鈣內(nèi)流所致。