肝素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用及其機(jī)制研究.pdf

1、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞主要對(duì)神經(jīng)元起支持作用。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷，如外傷、局部缺血和缺氧等，星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)由靜息態(tài)進(jìn)入活化態(tài)，即發(fā)生星形化，從而參與突觸形成和神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)。在急性損傷期，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用，它不但能夠提供營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)再生，還能將損傷區(qū)與正常組織進(jìn)行隔離，防止損傷面積的擴(kuò)大。但是，當(dāng)損傷進(jìn)入慢性期，以活化星形膠質(zhì)細(xì)胞等為主要成分的膠質(zhì)瘢痕會(huì)成為神經(jīng)再生的機(jī)械性屏障，不利于神經(jīng)損傷的修復(fù)

2、。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的具體機(jī)制成為神經(jīng)損傷修復(fù)治療中的一個(gè)關(guān)鍵內(nèi)容。
　　 肝素，是星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化時(shí)分泌量出現(xiàn)增長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)之一，本研究利用肝素的這一性質(zhì)，將其作用于大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，從形態(tài)、增殖和遷移的角度證實(shí)肝素誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的性質(zhì)，制備能夠模擬體內(nèi)活化且程度可控的體外模型，并進(jìn)一步探究誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化的內(nèi)在分子機(jī)制，為神經(jīng)損傷治療的有效進(jìn)行提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文的主要內(nèi)容如下:
　　 1、

3、原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及純化。以經(jīng)典的McCarthy法為基礎(chǔ)，取新生大鼠的大腦皮層，消化后得到星形膠質(zhì)細(xì)胞懸液，培養(yǎng)10天后通過(guò)搖床過(guò)夜振搖的方法去除生長(zhǎng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞上層的少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。為了提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度，我們?cè)诮臃N細(xì)胞時(shí)采取差速黏附的方法減少成纖維細(xì)胞的污染，經(jīng)過(guò)免疫熒光染色鑒定，培養(yǎng)細(xì)胞的GFAP陽(yáng)性率從80％上升至95％以上，滿足了后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞純度的要求。
　　 2、肝素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化作用的研

4、究。首先，通過(guò)伊紅染色和GFAP免疫熒光染色的方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果顯示肝素聯(lián)合FGF-2以劑量依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞骨架發(fā)生重組，細(xì)胞由多角形的靜息態(tài)向星形的活化態(tài)轉(zhuǎn)變;隨后的WesternBlotting結(jié)果顯示，肝素可以提高星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP的表達(dá)量，進(jìn)而證實(shí)肝素聯(lián)合FGF-2能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化。然后，通過(guò)BrdU摻入法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示肝素聯(lián)合FGF-2以劑量依賴的方式增加發(fā)

5、生DNA復(fù)制的細(xì)胞比例，而且能夠促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)變，提高細(xì)胞的增殖率。最后，通過(guò)Transwell小室法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移情況，結(jié)果顯示肝素聯(lián)合FGF-2提高了星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力。
　　 3、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制研究。通過(guò)抑制劑篩選、WesternBlotting和PCR等方法檢測(cè)參與調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號(hào)通路，結(jié)果顯示MAPK中的ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路以及細(xì)胞膜上的N-鈣粘素參與了肝素對(duì)星形膠